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Jun 27, 2023

Nature Microbiology Band 7, Seiten 1376–1389 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Die SARS-CoV-2-Omicron-Variante weist ein sehr hohes Übertragungsniveau auf, ist resistent gegen die Neutralisierung durch zugelassene therapeutische humane monoklonale Antikörper (mAb) und ist weniger empfindlich gegenüber einer durch Impfstoffe vermittelten Immunität. Um zusätzliche Therapien gegen Omicron bereitzustellen, isolierten wir einen mAb namens P2G3 aus einem zuvor infizierten geimpften Spender und zeigten, dass er eine neutralisierende Aktivität im pikomolaren Bereich gegen Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 und alle anderen getesteten Varianten aufweist. Wir haben die Struktur von P2G3 Fab im Komplex mit dem Omicron-Spike mithilfe von Kryo-Elektronenmikroskopie mit einer Auflösung von 3,04 Å gelöst, um das P2G3-Epitop als einen mAb der Klasse 3 zu identifizieren, der sich von den zuvor berichteten mAb-bindenden Spike-Epitopen unterscheidet. Mithilfe eines SARS-CoV-2-Omicron-Affen-Challenge-Modells zeigen wir, dass P2G3 allein oder in Kombination mit P5C3 (einem zuvor identifizierten breit aktiven Klasse-1-mAb) vollständigen prophylaktischen oder therapeutischen Schutz bietet. Obwohl wir in vitro auf SARS-CoV-2-Mutanten selektieren konnten, die der Neutralisierung durch P2G3 oder P5C3 entgehen, hatten sie eine geringe Infektiosität und „Flucht“-Mutanten sind in öffentlichen Sequenzdatenbanken äußerst selten. Wir kommen zu dem Schluss, dass diese Kombination von mAbs Potenzial als Anti-Omicron-Medikament hat.

SARS-CoV-2 ist weltweit für mehr als 340 Millionen bestätigte Infektionen und mehr als 5,5 Millionen Todesfälle verantwortlich1. Seine Ausbreitung hat zur Entstehung besorgniserregender Varianten (VOC) geführt, die übertragbarer und resistenter gegen Immunreaktionen sind. VOCs, die im Vergleich zum ursprünglichen SARS-CoV-2-Stamm eine hohe Anzahl an Mutationen aufweisen, überwiegen, wobei Delta (B.1.617.2) und seine 11 bis 15 Spike-Mutationen inzwischen weitgehend durch die hochinfektiöse Omicron-Variante (B.1.1.529.1) ersetzt wurden ), das bis zu 37 Aminosäuremutationen im Spike-Protein enthält2,3. Fünfzehn der Spike-Substitutionen in Omicron befinden sich in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD), der Region, auf die neutralisierende Antikörper abzielen (ob durch eine Infektion oder aktuelle Impfstoffe induziert), die alle gegen den ursprünglichen Wuhan-Stamm 2019-nCoV erzeugt wurden4,5,6,7 ,8. Omicron widersteht auch der Neutralisierung durch die meisten bisher gemeldeten Anti-SARS-CoV-2-mAbs9,10,11,12,13,14,15 und ist jetzt in mehreren Untervarianten im Umlauf, darunter BA.1.1, BA.2 (B.1.1). .529.2) und BA.3 (B.1.1.529.3)2, wodurch ein dringender ungedeckter medizinischer Bedarf sowohl an Prophylaxe als auch an Therapeutika entsteht.

Wir untersuchten das Vorhandensein von Anti-Spike-Antikörpern in Serumproben einer Kohorte von mehr als 100 Spendern und konzentrierten uns auf einen postinfizierten Spender, der zwei Dosen des mRNA-1273-Impfstoffs erhielt und einen der höchsten Serumantikörperspiegel mit ausgezeichneter Breite aufwies gegen eine Reihe von SARS-CoV-2-Varianten in einem trimeren Spike-ACE2-Ersatzneutralisationstest16. Das Screening von B-Zell-Klonüberständen auf hochaffine Spike-Bindung führte dazu, dass wir sechs Klone für die mAb-Produktion über die Expression gepaarter schwerer und leichter Ketten in ExpiCHO-Zellen priorisierten. Während der ersten Profilierung dieser gereinigten mAbs zeigte P2G3 die stärkste Bindungsaffinität für das ursprüngliche 2019-nCoV-Spike-Trimer und eine Reihe von Spike-Proteinen, die Mutationen kodieren, die in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-VOCs gefunden wurden (IC50-Werte von 0,006–0,010 µg ml−1). ) (Erweiterte Daten Abb. 1a). Wettbewerbsübergreifende Spike-RBD-Bindungsstudien, durchgeführt mit einer Reihe zugelassener oder klinisch fortgeschrittener Anti-SARS-CoV-2-mAbs (REGN10933 und REGN10987 von Regeneron17, AZD8895 und AZD1061 von AstraZeneca18, ADG-2 von Adagio19, S309/Sotrovimab von Vir/GSK20). ) und mAbs, die zuvor von unserer Gruppe21 beschrieben wurden, zeigen, dass P2G3 ein einzigartiges, wenn auch überlappendes Epitop mit denen bindet, die sowohl von AZD1061 als auch von S309/Sotrovimab erkannt werden, wobei letzteres durch einen Mechanismus wirkt, der sich von der Blockierung der RBD/ACE2-Wechselwirkung20 unterscheidet (Extended Data Abb. 1b). Wichtig ist, dass unser potenter und breit aktiver Klasse-1-mAb, P5C3, RBD nicht-kompetitiv mit P2G3 band, was uns dazu veranlasste, diese mAbs sowohl einzeln als auch in Kombination für nachfolgende Studien zu profilieren.

Mithilfe eines biochemischen Trimer-Spike-ACE2-Ersatzneutralisationstests16 stellten wir außerdem fest, dass P2G3 und P5C3 im Vergleich zu unserem Panel von Benchmark-mAbs (erweiterte Daten) die stärkste und breiteste Aktivität bei der Blockierung der ACE2-Bindung an hochwertige Spike-Trimere mit Strukturqualität aus allen früheren VOCs aufwiesen Abb. 1c,d). P2G3 und P5C3 zeigten auch die stärkste Aktivität in Tests, die mit dem Spike-Protein von Omicron BA.1, BA.1.1, das die R346K-Mutation enthält, und BA.2 durchgeführt wurden. (Abb. 1a,b). P2G3 allein ergab mit der P2G3/P5C3-Kombination vergleichbare Aktivitäten, wobei der Cocktail 6,1-, 47,2- und 3,4-fach verbesserte IC80-Werte im Vergleich zur AZD1061/AZD8895-Mischung und 9,9-, 12,4- und 340-fach verbesserte IC80-Werte im Vergleich zu ADG- aufwies. 2 und 375-, 337- und 32-fach verbesserte IC80-Werte im Vergleich zur REGN10933/REGN10987-Mischung in Tests, die mit Omicron BA.1, BA.1.1 bzw. BA.2 durchgeführt wurden. Interessanterweise erreichte die P2G3/P5C3-Kombination eine ~100 %ige Hemmung bei der Blockierung der ACE2-Bindung an Omicron-Spike-Proteine ​​bei 1 µg ml-1 Gesamt-mAbs, während P2G3 allein bei 20 µg ml-1 und P5C3 allein nur 50–72 % der ACE2-Bindung blockierte erreichte eine Hemmung von ~100 % bei 20 µg ml−1.

a, Blockierungsaktivität einzelner und Kombinationen von Anti-Spike-mAbs in einem biochemischen Spike-ACE2-Ersatzneutralisationstest unter Verwendung von Omicron BA.1, BA.1.1, das für die R346K-Mutation kodiert, und BA.2-Spike-Trimer-Proteinvarianten. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung. b: Vergleichende Spike-ACE2-Blockierungsaktivität von P2G3, P5C3 und der P2G3/P5C3-Mischung im Vergleich zu einer Reihe von Benchmark-Anti-SARS-CoV-2-mAbs. P2G3 und P5C3, die in diesen Studien und im gesamten Manuskript verwendet werden, enthalten die LS-Mutation in der Fc-Domäne (M428L/N434S), von der zuvor gezeigt wurde, dass sie in vivo eine verlängerte Halbwertszeit verleiht. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um biologische Replikate mit n = 8, 7, 8, 8, 7, 5, 6, 7 und 4 für mAbs in der Reihenfolge ihres Erscheinens in der Legende.

Quelldaten

Wir haben P2G3 allein oder in Kombination mit P5C3 mit unserem Panel aktuell klinisch zugelassener und/oder klinisch fortgeschrittener mAbs in Pseudovirus-Neutralisationstests verglichen. P2G3 hatte eine starke neutralisierende Aktivität gegen pseudotypisierte Lentiviren mit Spike aus dem ursprünglichen 2019-nCoV (D614G), Alpha-, Beta- und Delta-VOCs (IC80-Wert von 0,022, 0,051, 0,038 bzw. 0,035 µg ml−1). Wichtig ist, dass P2G3 das Spike-Pseudovirus Omicron BA.1 mit einem IC80-Wert von 0,038 µg ml−1 stark neutralisierte (Abb. 2a) und somit im Vergleich zu den anderen VOCs keinen Aktivitätsverlust zeigte. In direkten Vergleichen war P2G3 > 42-fach wirksamer als ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 und REGN10987 mAbs und 19-fach wirksamer als Sotrovimab bei der Neutralisierung von Omicron BA.1 Spike-pseudotypisierten lentiviralen Partikeln (Abb . 2b). Am zweitstärksten war P5C3 mit einem IC80-Wert von 0,223 µg ml−1, und die P2G3/P5C3-Kombination zeigte in diesem Test eine geringfügig erhöhte Aktivität gegenüber P2G3 allein mit einem IC80-Wert von 0,024 µg ml−1 für die Gesamtkonzentration der beiden mAbs. Darüber hinaus behielten P2G3 und P5C3 ihre volle neutralisierende Aktivität gegen die Vorfahren D614G und Omicron BA.1.1 bei, die für das R346K-Spike-Pseudovirus kodieren (Extended Data Abb. 2a,b), eine Mutation, die in etwa 10 % der Omicron-Variantensequenzen im GISAID11 vorkommt.

a, Neutralisierung lentiviraler Partikel, die mit SARS-CoV-2-Spike-exprimierenden VOCs pseudotypisiert wurden, in einem 293T-ACE2-Infektionstest. Alle Spike-Proteine ​​enthielten die D614G-Substitution, die zu Beginn der Pandemie dominant wurde. Die Replikate in den Konzentrations-Reaktionskurven betrugen n = 5, 5, 6, 8 und 6 für die Varianten 2019-nCoV, Alpha, Beta, Delta und Omicron. b, Neutralisierung lentiviraler Partikel, die mit der Spike-Variante der Omicron-Variante pseudotypisiert wurden. Antikörpercocktails stellen eine 1:1-Mischung jedes mAb dar, um die angegebene mAb-Gesamtkonzentration zu ergeben. Replikate für mAbs in der Reihenfolge ihres Auftretens in der Legende sind n = 9, 9, 9, 7, 7, 7, 7, 7 und 6. c–e, Neutralisierungsaktivität von P2G3, durchgeführt in einem lebenden infektiösen SARS-CoV-2-Virus Zytopathischer Effekttest (CPE). Die angegebenen SARS-CoV-2-Varianten wurden verwendet, um Vero-E6-Zellen in vitro in Abwesenheit und Anwesenheit einer Konzentrationsreaktion des angegebenen mAb zu infizieren. Virale Hemmungskurven werden für Delta (c, n = 4 Replikate), Omicron BA.1 (d, n = 4 Replikate) und Omicron BA.2 (e, n = 6 Replikate für P2G3 und P5C3, n = 4 für) angezeigt P2G3+P5C3 und n = 2 für die übrigen mAbs) Varianten für einzelne und mAb-Kombinationen. f, Wärmekarte, die die IC50- und IC80-Neutralisierungsstärken für die angegebenen mAbs in den Lebendvirus-CPE-Assays zeigt, berechnet aus c–e. Für a–e werden Mittelwerte ± Standardabweichung angezeigt.

Quelldaten

Als nächstes haben wir P2G3 unter Verwendung des ursprünglichen D614G-Stamms und aller aktuellen VOCs in einem Test auf zytopathische Wirkung von Lebendviren profiliert. P2G3 zeigte eine breite und starke neutralisierende Aktivität mit IC80-Werten von 0,028, 0,010, 0,017, 0,021, 0,024 und 0,035 µg ml−1 gegen den Stamm 2019-nCoV (D614G), Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- und Omicron-Varianten (IC80). im Bereich von 67–233 pM) (Extended Data Abb. 2c). Anschließend verglichen wir P2G3 mit anderen mAbs allein oder in Kombinationen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Delta- und die derzeit vorherrschenden Omicron BA.1- und BA.2-SARS-CoV-2-Varianten zu blockieren (Abb. 2c–f). Alle getesteten mAbs zeigten eine gute Aktivität gegen die Delta-Variante, obwohl Sotrovimab etwa 6-mal weniger wirksam als ADG-2 und > 10-mal weniger wirksam als P2G3, P5C3 und sowohl die AZD- als auch die REGN-Cocktails gegen dieses Virus war.

Bemerkenswert ist, dass P2G3 mit einem IC80-Wert von 0,035 µg ml−1 der mit Abstand aktivste mAb gegen Omicron BA.1 war, was etwa 23-fach, 60-fach und 88-fach wirksamer ist als der von AZD1061/AZD8895. Sotrovimab bzw. ADG-2, wobei die REGN-Kombination gegen diese Variante völlig wirkungslos war (Abb. 2d,f). Obwohl P5C3 einen IC80-Wert gegen Omicron im Bereich des AZD-Cocktails aufwies, zeigte die P2G3/P5C3-Kombination eine hohe Neutralisationsaktivität, vergleichbar mit P2G3 allein, mit einem IC80-Wert von 0,039 µg ml-1 Gesamt-mAb. P2G3 war erneut der wirksamste mAb bei der Neutralisierung der Omicron BA.2-Variante mit einem IC80-Wert von 0,014 µg ml−1, was 4,9-fach, 14-fach, 907-fach und 607-fach wirksamer als AZD1061/AZD8895 ist. REGN10933/REGN10987, ADG-2 bzw. Sotrovimab (Abb. 2e – f). Wichtig ist, dass, obwohl der Spike-ACE2-Ersatzneutralisationstest gut mit zellbasierten Neutralisationstests korreliert16, P2G3 nur ~50–72 % der ACE2-Bindung an Omicron-Spike-Proteine ​​blockierte (Abb. 1a), obwohl P2G3 100 % des maximalen Signals in a erreichte direkter Bindungsassay (Extended Data Abb. 1e). Dies deutet darauf hin, dass zumindest bei der Omicron-Variante die Virushemmung durch P2G3 möglicherweise nicht ausschließlich durch die Spike-ACE2-Wechselwirkung vermittelt wird, sondern vielmehr durch einen Mechanismus, der dem von S309/Sotrovimab analog ist und Berichten zufolge über die Induktion der Spike-Trimer-Vernetzung erfolgt , sterische Hinderung, Aggregation von Virionen20 und/oder Hemmung der viralen Membrananhaftung über C-Typ-Lectinrezeptoren22.

Angesichts der potenziellen Bedeutung der funktionellen Aktivität von Antikörpern, die durch die konstante Immunglobulin-Fc-Region vermittelt wird und zu einer effizienteren Viruskontrolle und -clearance führen kann23,24,25, untersuchten wir P2G3-Aktivitäten in der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) und der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität Phagozytosetests (ADCP). ADCC ermöglicht die gezielte Abtötung von Zellen, die SARS-CoV-2-Spike-Protein an der Membranoberfläche aufweisen, und unser In-vitro-Assay verwendet CEM-NKR-Zellen, die 2019-nCoV-Spike stabil exprimieren, kultiviert mit primären Effektorzellen von gesunden Spendern in An- und Abwesenheit von Anti-Spike-mAbs. P2G3-mAb zeigte eine robuste ADCC-Aktivität, die im Vergleich zu allen anderen getesteten Anti-Spike-mAbs beim Abtöten von Spike-positiven Zellen überlegen war (Erweiterte Daten, Abb. 3a). Obwohl diese Studien nicht mit einer Omicron-Spike-stabilen Zelllinie durchgeführt wurden, wird allgemein angenommen, dass die funktionelle ADCC-Aktivität gegenüber den verschiedenen SARS-CoV-2-VOCs für mAbs, die die Bindung der Spike-Variante bewahren, erhalten bleibt26. Als nächstes bewerteten wir die ADCP-Aktivität unter Verwendung von 2019-nCoV- oder Omicron BA.1-Spike-Trimer-beschichteten Fluoreszenzkügelchen, gemischt mit verschiedenen Konzentrationen von P2G3 und/oder P5C3 und dann inkubiert mit U937-Effektorzellen. Diese Monozyten-Zelllinie exprimiert hohe Mengen an Fc-Gamma-Rezeptoren, die wie in unserem Assay die Phagozytose opsonisierter Viren oder mit dem Spike-Antigen beschichteter Perlen induzieren können (Extended Data Abb. 3b). Bei alleiniger Verwendung zeigten P2G3- und P5C3-mAbs ADCP-IC80-Aktivitäten von 0,074 bzw. 0,010 µg ml−1, wobei P5C3 eine etwa siebenfach höhere Wirksamkeit aufwies. Im Gegensatz dazu zeigte P2G3 bei Verwendung von mit Omicron-Spikes beschichteten Perlen eine starke ADCP-Aktivität, die im Vergleich zu P5C3 um das Dreifache verbessert war. In Studien, die sowohl mit Ancestral- als auch mit Omicron-Spike durchgeführt wurden, zeigte die P2G3/P5C3-Mischung erhöhte ADCP-Aktivitäten im Vergleich zu einzeln verwendeten mAbs (Erweiterte Daten, Abb. 3c, d). Bemerkenswert ist, dass P2G3 und P5C3, die in diesen Fc-vermittelten funktionellen Aktivitätstests und im gesamten Artikel verwendet werden, die LS-Mutation in der Fc-Domäne (M428L/N434S) enthalten, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie in vivo eine verlängerte Halbwertszeit verleiht27, ein äußerst wünschenswertes Merkmal für prophylaktische Anwendung.

Nachdem wir die überlegene neutralisierende Wirkung von P2G3 in vitro nachgewiesen hatten, untersuchten wir als nächstes die neutralisierende Wirksamkeit von P2G3 in vivo in einem prophylaktischen Hamster-Challenge-Modell einer SARS-CoV-2-Infektion. Mit Antikörpern behandelte Tiere wurden 2 Tage später mit einer intranasalen Impfung des ursprünglichen 2019-nCoV SARS-CoV-2-Virus (Extended Data Abb. 4a) herausgefordert und 4 Tage später wurde das Lungengewebe des Hamsters auf infektiöse Viren und virale RNA überwacht. Bei fast allen mit P2G3 behandelten Hamstern war in der Lunge ein infektiöses Virus nicht nachweisbar, wobei nur einer von sechs Hamstern in der Gruppe mit der niedrigsten Dosis von 0,5 mg/kg im Vergleich zu den mit Isotyp-mAb behandelten Kontrolltieren verringerte, wenn auch nachweisbare Konzentrationen an infektiösem Virus aufwies (Erweiterte Daten). Abb. 4b). Ein vollständiger prophylaktischer Schutz wurde bei P2G3-mAb-Plasmaspiegeln von >6,2 µg ml−1 zum Zeitpunkt der Virusinokulation beobachtet, und P2G3-Behandlungsgruppen zeigten eine signifikante Reduzierung der genomischen viralen RNA-Spiegel um ca. 4 log (Extended Data, Abb. 4c).

Als nächstes untersuchten wir den P2G3-vermittelten Schutz vor einer Infektion mit SARS-CoV-2 Omicron BA.1 in einer Präexpositionsstudie mit Cynomolgus-Makaken. Affen (n = 2) wurden 10 mg kg−1 P2G3 LS intravenös verabreicht und 72 Stunden später über kombinierte intranasale und intratracheale Wege mit 1 × 105 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) von SARS-CoV-2 B.1.1 infiziert .519 Omicron BA.1-Virus (Abb. 3a). Nach der Virusbelastung zeigten Kontrolltiere (n = 4) ähnliche genomische (g)RNA-Spiegel und Kinetiken mit einer mittleren maximalen Viruslast (VL) von 6,9 und 6,6 log10 Kopien pro ml gRNA 2–3 Tage nach der Belastung in der Luftröhre Abstrichproben bzw. Proben aus bronchoalveolärer Lavage (BAL) (Abb. 3b). Nasopharyngeale Abstriche zeigten eine höhere Variabilität der VL zwischen Kontrolltieren, zeigten jedoch immer noch mittlere Spitzenwerte von 6,9 log10 Kopien pro ml für gRNA. Im Vergleich dazu wiesen die beiden mit P2G3 LS behandelten Affen eine starke mittlere Peak-ΔVL-Reduktion von 3,8, 2,5 und 3,9 log10 Kopien pro ml gRNA für tracheale, nasopharyngeale bzw. BAL-Proben auf.

a, Überblick über das Studiendesign für das SARS-CoV-2 NHP-Challenge-Modell. Den Tieren MF1 und MF2 wurden 10 mg kg−1 P2G3 intravenös verabreicht und 3 Tage später (Tag 0) zusammen mit den Kontrolltieren MF3 und MF4 durch intranasale und intratracheale Inokulation mit dem Omicron BA.1 SARS-CoV-2-Virus (1 ×) provoziert 105 TCID50). b,c: Trachealabstriche (links), Nasopharynxabstriche (Mitte) und bronchoalveoläre Lavagen (BAL, rechts), die im Verlauf der Studie durchgeführt wurden, wurden auf Viruskopien pro ml gRNA (b) und sgRNA (c) untersucht, mit Daten Dargestellt wurden zwei historische Kontrolltiere (MF5* und MF6*), die mit demselben Inokulum des Omicron-Virus infiziert waren. d: Die Durchflusszytometrie-Analyse von Blutproben von NHPs, die während der Studie gesammelt wurden, zeigt eine starke Lymphopenie bei Kontrolltieren nach der Herausforderung mit Omicron SARS-CoV-2, während mit P2G3 LS behandelte Affen stabile Lymphozytenwerte aufweisen. Die gepunktete Linie zeigt die untere Nachweisgrenze bei 2,68 bzw. 2,87 log-Kopien pro ml für virale gRNA bzw. sgRNA.

Quelldaten

Die aktive Virusreplikation, gemessen anhand der subgenomischen (sg)RNA-Spiegel, erreichte 2–3 Tage nach der Belastung ihren Höhepunkt, wobei Trachealabstriche und BAL mittlere Werte von 4,8 bzw. 4,5 log10 Kopien pro ml aufwiesen und Nasopharynxproben unterschiedliche Reaktionen zeigten im Bereich von nicht nachweisbar (<2,9-log10) bis 5,4-log10 Kopien pro ml (Abb. 3c). Mit P2G3 LS behandelte Affen wiesen sgRNA-Spiegel auf oder unter der Nachweisgrenze auf und zeigten um 1,9, 2,2 und 1,6 log10 reduzierte Werte in trachealen, nasopharyngealen und BAL-Proben. Im Einklang mit dem Virusschutz, der zu einem verringerten Nachweis von gRNA und sgRNA führte, zeigten mit P2G3 behandelte Affen während der gesamten Studie stabile Lymphozytenwerte, wohingegen bei allen mit P2G3 behandelten Affen eine starke Lymphopenie beobachtet wurde, die durch Lymphozytenwerte unter 2,1 × 103 Zellen pro µl bestimmt wurde Omicron-Variante von SARS-CoV-2 (Abb. 3d).

In einer zweiten Studie zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von mAb wurden Affen wie oben mit dem SARS-CoV-2 B.1.1.519 Omicron BA.1-Virus infiziert und dann 24 Stunden nach der Belastung wurden die Tiere in drei Gruppen entweder unbehandelt gelassen (n = 4). ) oder eine P2G3 LS + P5C3 LS-Kombination mit 5 + 5 mg kg−1 (n = 6) oder 2,5 + 2,5 mg kg−1 (n = 6) durch eine einzelne intravenöse Injektion verabreicht (Abb. 4a). Tracheal-, Nasopharyngeal- und BAL-Proben, die in Längsrichtung für jeden Affen gesammelt wurden, wurden sowohl auf gRNA- (Abb. 4b) als auch auf sgRNA-Viruskopien (ergänzende Abb. 1) pro ml untersucht. In Übereinstimmung mit der prophylaktischen Challenge-Studie zeigten Kontrolltiere vergleichbare gRNA-Spiegel und kinetische Profile mit einem mittleren Spitzen-VL von 6,7 und 6,1 log10 Kopien pro ml 2–3 Tage nach der Challenge in Trachealabstrichen und BAL-Proben und erhöhten, aber variableren Werten nasopharyngeale VL-Werte von 6,5 log10 Kopien pro ml gRNA (Abb. 4c). Wichtig ist, dass Affen im Kombinationsbehandlungsarm mit 5 + 5 mg kg−1 P2G3 LS + P5C3 LS einen starken, signifikant reduzierten mittleren Peak-ΔVL von 2,1- und 1,5-log10 für Tracheal- und BAL-Proben zeigten (jeweils P = 0,0095). und 1,2-log10 Kopien pro ml gRNA für nasopharyngeale Proben (Abb. 4c). In ähnlicher Weise zeigten Affen, die mit der niedriger dosierten mAb-Kombination von 2,5 + 2,5 mg kg–1 behandelt wurden, eine mittlere maximale ΔVL-Reduktion von 0,85–1,1 bzw. 1,2 log10 Kopien pro ml gRNA für Tracheal-, BAL- und Nasopharyngealproben, wobei BAL-Proben signifikante Werte zeigten reduzierte Werte (P = 0,0095) (Abb. 4c). Die therapeutische Wirksamkeit wurde darüber hinaus durch die Überwachung der Fläche unter der Kurve (AUC) der gRNA-Spiegel nachgewiesen, wobei die hoch- und niedrigdosierte P2G3 LS + P5C3 LS-Kombination eine signifikante 4- bzw. 2,5-fache Reduzierung der in der Luftröhre nachgewiesenen Viren bewirkte (P = 0,0095 und). 0,0190) und 2,5- bzw. 2,2-fach reduzierte gRNA-AUC-Werte in Nasopharyngealflüssigkeiten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollaffen (Abb. 4d).

a, Überblick über das Studiendesign für das therapeutische SARS-CoV-2-NHP-Challenge-Modell. Den Tieren wurde am Tag 0 eine intranasale und intratracheale Inokulation mit dem Omicron BA.1 SARS-CoV-2-Virus (1 × 105 TCID50) verabreicht, und 24 Stunden später wurde NHP der Gruppe 2 (G2, rote Kreise, n = 6) intravenös verabreicht 5 mg kg−1 P2G3 LS und 5 mg kg−1 P2G3 LS, Gruppe 3 (G3, rosa Kreise, n = 6) erhielten 2,5 mg kg−1 P2G3 LS und 2,5 mg kg−1 P2G3 LS, und Gruppe 1 (G1, graue Kreise, n = 4) wurden als unbehandelte Referenzkontrollen verwendet. b–e: Trachealabstriche, Nasopharynxabstriche und bronchoalveoläre Lavagen (BAL), die im Verlauf der Studie durchgeführt wurden, wurden auf Viruskopien pro ml gRNA (b–d) und sgRNA (e) untersucht. Die Studiengruppen wurden hinsichtlich Peak-gRNA (c), Fläche unter der Kurve für gRNA (d) und sgRNA-Peak-Viruskopien pro ml (e) in den verschiedenen gesammelten Proben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten bewertet. Die gepunktete Linie zeigt die untere Nachweisgrenze bei 2,68 bzw. 2,87 log-Kopien pro ml für virale gRNA bzw. sgRNA. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Zweiseitige Mann-Whitney-Tests wurden durchgeführt, um die Studiengruppen in c, d und e zu vergleichen; **P = 0,0095 für alle in c; **P = 0,0095 und *P = 0,019 für d; ***P = 0,0005, **P = 0,0062, 0,0095, 0,0095 (von links nach rechts) für z.

Quelldaten

Die aktive Virusreplikation wurde auch in den Behandlungsarmen mit hoher und niedriger Dosis signifikant gehemmt, wobei Trachealabstriche an den Tagen 2/3 nach der Belastung eine 41- bzw. 8,8-fache Reduktion der sgRNA zeigten (P = 0,0005 bzw. 0,0062) (Abb. 4e). . P2G3 LS + P5C3 LS-Behandlungskombinationen reduzierten außerdem die sgRNA in BAL-Proben um das 6,2- und 8,8-fache im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollaffen (P = 0,0095 für beide) (Abb. 4e). Insgesamt unterstützen diese Studien nachdrücklich die therapeutische Wirksamkeit der P2G3 LS + P5C3 LS-Kombination bei der Virusbeseitigung und der Hemmung der aktiven Virusreplikation der hochrelevanten Omicron BA.1-Variante.

Um die molekularen Merkmale zu entschlüsseln, die der starken Neutralisierung des Omicron-Spikes durch P2G3 und P5C3 zugrunde liegen, führten wir eine Einzelpartikel-Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Rekonstruktion der an beide Fabs gebundenen trimeren Omicron-Spike-Ektodomäne12,28,29 mit einer Auflösung von 3,04 Å durch (Abb. 5a, erweiterte Daten Abb. 5 und 6 und ergänzende Datentabelle 1). Wir fanden heraus, dass die Fabs gleichzeitig an verschiedenen Stellen auf dem Trimer binden, wobei die meisten Bilder drei P2G3-Fabs zeigten, die entweder an Up- oder Down-RBD-Konformationen gebunden waren, und ein P5C3-Fab, das an eine Up-RBD gebunden war. Die Region des Omicron RBD, die mit dem P5C3-mAb der Klasse 1 interagiert, ist identisch mit der zuvor für den D614G-Spike beschriebenen Region (Extended Data Abb. 5–7)21. P2G3 bindet als neutralisierender mAb4 der Klasse 3 eine Oberfläche von etwa 700 Å2 und erkennt ein Epitop auf dem SARS-CoV-2-RBD, das sich vom Rezeptorbindungsmotiv unterscheidet, wobei die beiden mAbs zusammen eine Oberfläche von >1.200 Å2 bedecken (Abb. 5b). und Erweiterte Daten Abb. 7a und 8a). Um die P2G3-Paratop- und Epitop-Schnittstelle im Detail zu charakterisieren, führten wir eine lokale Verfeinerung der P2G3-Fab-RBD-Interaktionsregion durch und erreichten eine Auflösung von 3,84 Å mit wohldefinierter Dichte, was eine klare Interpretation der Seitenkettenpositionen ermöglichte (Extended Data Abb. 6 und 8). und ergänzende Abbildung 2 und Datentabelle 1). Das P2G3-Paratop besteht aus vier Schleifen der komplementaritätsbestimmenden Region (CDR), die an der Rückseite des RBD binden. Die Wechselwirkungen werden durch elektrostatische und hydrophobe Kontakte vermittelt (Abb. 5c, d und erweiterte Daten Abb. 8b, c) und umfassen 16 Reste des RBD, die hauptsächlich durch die schwere Kette des P2G3-mAb gebunden sind. Das 18 Reste lange CDRH3 sitzt an der Spitze einer Schleife, die die Reste 344–347 umfasst, und kontaktiert auch die Aminosäuren an den Grenzen des 5-strängigen β-Faltblatts (Reste 440–451), was insgesamt >60 Reste ausmacht % der vergrabenen Oberfläche (431 Å2) (Erweiterte Daten Abb. 8a–c). Die Wechselwirkungen zwischen P2G3 und dem Omicron-RBD bleiben sowohl im RBD-Up- als auch im RBD-Down-Zustand erhalten (Extended Data Abb. 8c, d). CDRH2 erweitert das Epitop durch Wechselwirkung mit R346, das durch den Rest W53 über eine potenzielle Kation-Pi-Wechselwirkung involviert ist (Abb. 5d und erweiterte Daten, Abb. 8e), eine Wechselwirkung, die wahrscheinlich bei der R346K-Spike-Substitution erhalten bleibt (erweiterte Daten, Abb. 2a). ,B). Der einzige potenzielle Kontakt der leichten Kette entsteht dadurch, dass CDRL1 Y32 eine hydrophobe Wechselwirkung mit V445 des RBD eingeht (Extended Data Abb. 8c). Darüber hinaus wird beobachtet, dass P2G3 nur mit RBD-Aminosäureresten in Kontakt kommt und der Abstand zum nächstgelegenen Atom des Glykanzweigs von P2G3 etwa 10 Å beträgt. Wichtig ist, dass das durch unsere Strukturstudien definierte Epitop die starke neutralisierende Aktivität von P2G3 gegen die Omicron-Variante im Vergleich zu anderen Klasse-3-mAbs erklärt. Die Omicron-Mutationen S371L, N440K, G446S und die Nebenvariante R346K befinden sich alle außerhalb des P2G3-bindenden Epitops, grenzen an dieses an oder haben kaum Einfluss auf dessen Erkennung, wohingegen zwei oder mehr dieser Mutationen sich direkt auf die von REGN10987 erkannten Epitope auswirken. AZD1061 und S309/Sotrovimab (Abb. 5e). Darüber hinaus weist P2G3 eine einzigartige Bindungsorientierung an der RBD auf, wobei sein Fab von den meisten dieser Omicron-Mutationen abweicht (Abb. 5f). Bei der Modellierung der beobachteten Angriffswinkel verschiedener mAbs der Klasse 3 ist es möglich, dass REGN10987 nur an die Up-RBD-Form bindet, während AZD1061 eine Up- und eine Down-RBD-Form bindet, wobei sterische Hinderung die dritte RBD-Stelle auf dem Omicron blockiert Spike-Trimer (Extended Data Abb. 9). Im Gegensatz dazu binden P2G3 und S309/Sotrovimab wahrscheinlich sowohl die Up- als auch die Down-Form von Omicron RBD ohne Konflikte (Abb. 5g und Extended Data Abb. 9c), eine Eigenschaft, die zur weitgehend konservierten und hohen Wirksamkeit von P2G3 über VOCs hinweg beitragen könnte.

a, Kryo-EM-Komposit-Dichtekarte des Omicron-Spikes voller Länge, gebunden an ein P5C3- und drei P2G3-Fab-Fragmente. Spike-Protomer sind in Grün, Orange und Blau gefärbt, P5C3-Fabs in Dunkel- und Hellorange, P2G3 in Schwarz und Grau. b, Oberflächendarstellung des RBD in der Up-Konfiguration (grün), gebunden an P5C3 und P2G3, wobei schwere und leichte Ketten als Lakritzbänder dargestellt sind. Der von den Fabs gebildete vergrabene Oberflächenbereich wird auf der RBD-Oberfläche dargestellt und ist für P2G3 grau und für P5C3 orange gefärbt. Die Omicron-Mutationen werden in Gelb als Kugeln und Stäbchen und transparente Oberflächen dargestellt. Die N-verknüpften Glykane an Asparagin 331 und 343 sind als Stäbchen dargestellt. Das rechte Feld zeigt eine 180°-Drehung des RBD/P2G3/P5C3-Komplexes relativ zum linken Feld. c, Vergrößerte Ansicht der interagierenden Region von P2G3 mit CDR-Schleifen der angegebenen schweren und leichten Ketten. Omicron-Mutationen sind gelb hervorgehoben. d, Detaillierte Analyse der Wechselwirkungen zwischen der Omicron-RBD, dargestellt als Bänder (grün), und den P2G3-Fab-Schwer- und -Leichtketten, dargestellt als Lakritze (schwarz und grau). Rückstände an der Grenzfläche werden als Stäbchen dargestellt, mögliche Interaktionen von Interesse werden als gestrichelte Linien dargestellt. Omicron-Mutationen werden als Kugeln und Stäbchen in Gelb dargestellt. e: Strukturen mehrerer an RBDs gebundener Klasse-3-Antikörper (Fabs) wurden auf dem Omicron RBD überlagert. Der von den angegebenen Fabs gebildete vergrabene Oberflächenbereich ist auf der RBD-Oberfläche umrissen und entsprechend eingefärbt (Fab-RBD-Strukturen AZD1061, PDB-7L7E; REGN10987, PDB-6XDG; S309, PDB-7BEP). Die Omicron-Mutationen werden in Gelb als Kugeln und Stäbchen und transparente Oberflächen dargestellt. f: Der Anstellwinkel der Fab-Bindung zum RBD ist definiert als die Linie, die den Schwerpunkt des Fab mit dem Schwerpunkt der Oberfläche des RBD verbindet, die die Fabs vergraben. Der Angriffswinkel von P2G3 wird aus mehreren Blickwinkeln mit dem anderer Klasse-3-Antikörper verglichen. RBD ist grün, Omicron-Mutationen gelb. g: Die Bindung von P2G3 an das vollständige Omicron-Trimer wurde modelliert, indem die Fabs auf die RBD jedes Protomers gelegt wurden. Der Komplex wird von verschiedenen Seiten und von oben gezeigt. P2G3-Fabs sind in der Lage, alle RBD-Up- und RBD-Down-Konformationen gleichzeitig zu binden.

Monoklonale Antikörper werden wie andere Klassen antiviraler Medikamente typischerweise in Kombination eingesetzt, um die Entstehung resistenter Viren zu verhindern. Um einen Einblick in den vorhergesagten klinischen Wert unserer mAbs zu erhalten, haben wir die Entstehung von Mutanten charakterisiert, die ihrer Blockade in Gewebekulturen entkommen. Zu diesem Zweck haben wir die Varianten SARS-CoV-2 Delta und Omicron BA.1 in Gegenwart suboptimaler neutralisierender Dosen von P2G3 oder P5C3 für drei Passagen gezüchtet, um eine heterogene Viruspopulation zu erzeugen, bevor wir auf strenge mAb-Konzentrationen umgestiegen sind, um echte Flüchtlinge auszuwählen (Abb. 6a). Die virale Genomsequenzierung dieser mAb-resistenten Mutanten zeigte die Bedeutung der Spike-Substitutionen G476D, F486S und N487K/D/S für die Flucht aus P5C3 und K444T für die Vermeidung der P2G3-Neutralisierung. Daher haben wir den Einfluss dieser Mutationen auf die virale Infektiosität mithilfe von Lentivektor-Pseudotypen getestet. P5C3-entkommende Spike-Proteine ​​waren deutlich weniger infektiös als die Wildtyp-Kontrolle sowohl im angestammten D614G- als auch im Delta-Hintergrund, was mit einem Abfall der Affinität für den viralen ACE2-Rezeptor in einem In-vitro-Bindungstest korrelierte, während dies bei der P2G3-entkommenden K444T-Substitution der Fall war ein milderer Effekt in beiden Tests (Abb. 6b, c). Eine Untersuchung der GISAID EpiCoV-Datenbank ergab jedoch, dass die bei P5C3-Flüchtlingen gefundenen Mutationen G476D, F486S oder N487K/D/S nur in Ausnahmefällen in SARS-Cov-2-Isolaten vorkommen und zusammen nur 0,0087 % der 8.568.006 verfügbaren Sequenzen (Stand März) ausmachen 2022, und dass die K444T-Mutation ebenso selten ist (0,0024 % der zusammengestellten Sequenzen), was stark darauf hindeutet, dass die entsprechenden Viren in freier Wildbahn eine deutlich eingeschränkte Fitness aufweisen. Darüber hinaus zeigten Kreuzneutralisationsstudien, dass P2G3 die Infektiosität von P5C3-entkommenden Delta-Derivaten vollständig blockierte (Abb. 6d) und dass P5C3 und P2G3 die Escape-Mutanten des jeweils anderen im Delta-Hintergrund effizient kreuzneutralisierten (Extended Data, Abb. 10).

a, Schematische Darstellung der Auswahl der Ausreißer. Replikative Isolate von Delta und Omicron wurden verwendet, um Vero E6-Zellen (MOI von 0,2) jeweils in zweifacher Ausführung in Gegenwart suboptimaler Antikörperkonzentrationen zu infizieren. Die Überstände wurden gesammelt, 40-fach verdünnt und zur Infektion von Zellen für zwei weitere Passagen unter den gleichen Bedingungen (P1 bis P3) verwendet. Mutmaßliche virale Flüchtlinge wurden außerdem durch serielle Passagen von zweifach verdünnten Überständen selektiert, die mit hohen Konzentrationen an Antikörpern vorinkubiert waren (drei Konzentrationen, jeweils doppelt getestet). Virale RNA, die aus den bei jeder Passage gesammelten Überständen extrahiert wurde, wurde tief sequenziert und der P5-Virusüberstand für CPE-basierte Neutralisationstests verwendet. b, Mutationen, die in Escape-Selektionsexperimenten identifiziert wurden, sind in der Tabelle angegeben. Pseudotypisierte Lentivvektoren mit an den identifizierten Resten mutierten Spikes wurden parallel zu Beständen hergestellt, die auf den p24-Gehalt angepasst waren, und die gleiche Menge jedes Lentivvektors wurde zur Transduktion von 293T-ACE2-Zellen verwendet. Im D614G-Panel waren die Replikate von links nach rechts n = 36, 36, 8, 8, 28 und 28. Das Delta-Varianten-Panel hat n = 39, 36, 8, 8, 34 bzw. 34 Replikate. Die Transduktionseffizienz wurde durch die Luciferase-Aktivität (RLU) in den transduzierten Zellen überwacht. c: Die direkte Bindung von ACE2 an mutierte trimere Spikes wurde durch Luminex-basierte Bindungstests überwacht (n = 2–3 biologische Replikate). d, Vero E6-Zellen wurden in Duplikaten mit normalisierten Mengen an Delta- oder Delta-P5C3-Flüchtlingen infiziert, die aus den Fluchtversuchen entnommen und wie angegeben mit dreifachen Reihenverdünnungen von mAbs vorinkubiert wurden oder nicht. Die zytopathische Wirkung wurde 2 Tage später durch Kristallviolettfärbung der lebenden Zellen überwacht. Graue und orangefarbene Quadrate: mit Viren infizierte Zellen in Abwesenheit von mAbs bzw. nicht infizierte Zellen. Kruskal-Wallis-Tests mit Dunns Mehrfachvergleichskorrektur wurden durchgeführt, um Wildtyp und Mutanten zu vergleichen: für b, *P = 0,028 und 0,045 (von links nach rechts), **P = 0,0026 und 0,0086 (von links nach rechts) und * ***P < 0,0001; NS, nicht signifikant; für c gilt *P = 0,046 und **P = 0,0088. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar

Quelldaten

Wir berichten über die Identifizierung und Charakterisierung von P2G3, einem Anti-SARS-CoV-2-mAb mit überlegener Breite und Wirksamkeit, der bisher alle VOCs neutralisieren kann, einschließlich der kürzlich identifizierten Omicron BA.1- und BA.2-Varianten. Strukturelle und kompetitive Bindungsstudien zeigen, dass P2G3 ein mAb der Klasse 3 ist, der ein Epitop auf dem RBD erkennt, das sich von denen unterscheidet, die von allen anderen zugelassenen oder in einem fortgeschrittenen Entwicklungsstadium befindlichen therapeutischen mAbs gebunden werden8,10,11. Sequenzanalysen ergaben außerdem, dass das P2G3-HCDR3 nur eine 55-prozentige Identität mit einem der 4.897 bisher beschriebenen Anti-Spike-HCDR3 aufweist.

Kryo-EM ergab, dass P2G3 sowohl die Up- als auch die Down-RBD-Konformation des Spike-Trimers binden kann und eine große Oberfläche von etwa 700 Å2 in einem hochkonservierten RBD-Bereich vergräbt. Wichtig ist, dass das Bindungsepitop weitgehend nicht mit in Omicron mutierten Resten überlappt, ein einzigartiges Merkmal bei fast allen bisher gemeldeten wirksamen Anti-SARS-CoV-2-mAbs11. Die S371L-Omicron-Mutation allein reduziert die Neutralisierungsaktivität mehrerer potenter mAbs unterschiedlicher Bindungsklassen erheblich, obwohl sie nicht in deren Fußabdruck enthalten ist11, möglicherweise weil lokale Konformationsänderungen in der 370–375-Schleife die Up- und Down-RBD-Zustände beeinflussen und/oder diese stören der kritische Toröffner N343 Glykanpositionierung30; Diese Mutation hat jedoch keinen Einfluss auf die P2G3-Neutralisierung. Der einzigartige Angriffswinkel von P2G3 auf die RBD-Domäne, der voraussichtlich eine Bindung sowohl an den oberen als auch an den unteren RBD-Positionen des Spike-Trimers ermöglicht, könnte erklären, warum dieser Antikörper weiterhin wirksam gegen die Omicron-Variante aktiv ist.

Wir gingen davon aus, dass S309/Sotrovimab auch sterisch frei ist, um alle RBDs innerhalb des Omicron-Trimers zu binden, stellten jedoch fest, dass dieser Antikörper einen deutlichen Aktivitätsverlust gegen diese Variante aufwies. Obwohl das von P2G3 gebundene Epitop teilweise mit der von S309/Sotrovimab erkannten Region überlappt, blockiert der letztgenannte mAb nicht die RBD/ACE2-Wechselwirkung und es wurde vorgeschlagen, dass er über alternative Mechanismen wirkt, einschließlich der Hemmung der Zelladhäsion durch C-Typ-Lektine22. Daher trägt die verbesserte Bindungsaffinität von P2G3 in Kombination mit der zusätzlichen Hemmwirkung auf die RBD/ACE2-Wechselwirkung zur Erklärung seiner 10- bis 60-fach verbesserten Aktivität bei allen VOCs im Vergleich zu S309-Sotrovimab bei. Abgesehen von der In-vitro-Neutralisierungsaktivität verleiht P2G3 allein und/oder in Kombination mit P5C3 einen hervorragenden In-vivo-Schutz im SARS-CoV-2-Omicron-Provokationsmodell für nichtmenschliche Primaten (NHP) sowohl im prophylaktischen als auch im therapeutischen Bereich. Unsere NHP-Daten bestätigen auch Studien an Mäusen und Hamstern, die darauf hinweisen, dass die Omicron-Variante im Vergleich zu anderen VOCs in mehreren Tiermodellen eine verringerte Proliferationskapazität aufweist31,32.

Trotz des außergewöhnlichen Neutralisationsprofils von P2G3 gegenüber derzeit zirkulierenden Varianten ist die Entwicklung einer Resistenz unvermeidlich, wenn ein Virus unter Selektionsdruck steht. Wir berichten hier, dass P5C3, ein zuvor beschriebener wirksamer und breit aktiver neutralisierender mAb, der die Spike-ACE2-Wechselwirkung blockiert, nicht nur auf eine hochkonservierte Region des RBD abzielt, sondern gleichzeitig mit P2G3 auch Omicron-Spike binden kann. Wir identifizieren außerdem Mutanten, die in der Lage sind, der Neutralisierung durch einen dieser mAbs zu entgehen, zeigen jedoch, dass sie eine verringerte Infektiosität aufweisen, in freier Wildbahn äußerst selten sind (was auf eine verringerte Fitness hindeutet) und die Ausreißer des anderen effizient neutralisieren können, wodurch ihre Verwendung in Kombination validiert wird. Es ist bemerkenswert, dass P5C3 und P2G3 beide die jetzt vorherrschenden R346K-haltigen Omicron-Untervarianten BA.1.1 und BA.2 neutralisieren, die der Blockade durch andere derzeit verfügbare mAbs teilweise oder vollständig entgehen. Darüber hinaus sind die neu auftretenden Omicron BA.4- und BA.5-Varianten mit den RBD-Mutationen L452R und F486V vom P2G3-Bindungsepitop entfernt und haben wahrscheinlich keinen Einfluss auf die neutralisierende Aktivität2.

Viele der bisher bei der COVID-19-Pandemie erzielten Fortschritte, darunter COVID-19-Impfstoffe und wirksame neutralisierende mAbs, wurden innerhalb weniger Monate durch das Aufkommen der Delta- und Omicron-Varianten weitgehend zunichte gemacht. Die Omicron-Variante zeigt bei gesunden Spendern eine deutlich verringerte Empfindlichkeit gegenüber der impfstoffinduzierten humoralen Immunität, und was noch wichtiger ist, immungeschwächte Personen sind jetzt fast völlig ungeschützt, da sie nach der Impfung keine schützende humorale Immunantwort aufbauen können33. Für diese gefährdeten Personen schlagen wir vor, dass eine passive Immunisierung mit 2–3 Injektionen pro Jahr mit den P2G3- und P5C3-LS-mAbs mit verlängerter Halbwertszeit27, die gleichzeitig an hochkonservierte und unterschiedliche Epitope auf der Virusspitze binden können, eine attraktive Prophylaxeoption darstellen könnte34. Mit starker Neutralisierung, Fc-vermittelter funktioneller Aktivität und nachgewiesenem In-vivo-Schutz hat diese breit wirksame Kombination, vorbehaltlich einer erfolgreichen Entwicklung und Zulassung, das Potenzial, ein überlegener Anti-SARS-CoV-2-mAb-Cocktail für prophylaktische und therapeutische Interventionen gegen alle zu sein aktuelle VOCs und sein Wirkungsspektrum legen nahe, dass es in der Lage sein könnte, viele zukünftige VOCs von SARS-CoV-2 zu neutralisieren.

Die Proben mononukleärer Serum- und Blutzellen stammten von Spendern, die an den ImmunoCov- und ImmunoVax-Studien des Immunologie- und Allergiedienstes des Universitätsspitals Lausanne teilnahmen. Bei allen Teilnehmern handelte es sich um Erwachsene unterschiedlichen Alters, die eine Einverständniserklärung zur Verwendung biologischer Proben unterzeichnet hatten. Das Studiendesign und die Verwendung von Probandenproben wurden vom Institutional Review Board des Universitätsspitals Lausanne und der „Commission d'éthique du Canton de Vaud“ (CER-VD mit den Studienreferenznummern 2020-00620 bzw. 2021-00041) genehmigt.

SARS-Cov-2-Spike-Mutationen sind für alle geklonten Spike-Varianten und die entsprechenden Virusisolate ähnlich und in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Produktion der Varianten 2019-nCoV (D614G), B.1.17, B.1.351 und P.1 wurde bereits beschrieben21. RNA, die aus einer anonymisierten Restprobe einer Person isoliert wurde, bei der der Verdacht besteht, dass sie mit dem SARS-CoV-2-Omicron-Stamm infiziert ist, wurde revers in komplementäre DNA transkribiert. Die Omicron-Spike-Ektodomäne wurde durch PCR mit Primern (in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt) amplifiziert, die anhand einer Konsenssequenz aus verfügbaren Omicron-Sequenzen entworfen und durch Infusionsklonierung in das nCoV-2P-F3CH2S-Plasmid eingeführt wurden, wodurch der ursprüngliche Wildtyp-Spike29 ersetzt wurde. Die 2 Proline (P986–P987) und die Furin-Spaltungsstellenmutationen (Reste 682–685 mutiert zu GSAS), die das Spike-Protein im trimeren Präfusionszustand stabilisieren, wurden gleichzeitig durch PCR und infusionsvermittelte ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von Primern eingeführt in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt, wie zuvor beschrieben2, und der vollständige offene Leserahmen (ORF) von Omicron wurde sequenzverifiziert. Der Klon der Delta B1.617.2-Variante wurde durch Gensynthese mit einem Codon-optimierten Spike-ORF (GenScript) erzeugt. Die endgültigen Konstrukte kodieren die Spike-Ektodomänen, die ein natives Signalpeptid, die 2P- und Furin-Spaltungsstellenmutationen, eine C-terminale T4-Fold-on-Fusionsdomäne zur Stabilisierung des Trimerkomplexes, gefolgt von C-terminalen 8x His- und 2x Strep-Tags für Affinität enthalten Reinigung. Die trimeren Spike-Varianten wurden wie zuvor beschrieben hergestellt und gereinigt16. Die Reinheit der für Kryo-EM verwendeten Omicron-Spike-Trimere wurde durch SDS-PAGE-Analyse mit >99 % bestimmt. Die Biotinylierung von Spike- oder RBD-Proteinen wurde unter Verwendung von EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Life Technologies) mit einem dreifachen molaren Überschuss an Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Biotinylierte Proteine ​​wurden mit PBS unter Verwendung eines Amicon Ultra-0.5 mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 3 kDa gepuffert. Spike- und RBD-Tetramer wurden vor der Verwendung frisch hergestellt und durch Kombination biotinylierter Proteine ​​mit PE-konjugiertem Streptavidin (BD Biosciences) in einem Molverhältnis von 4:1 gebildet.

Luminex-Beads, die für die serologischen und gereinigten Antikörperbindungstests verwendet werden, wurden durch kovalente Kopplung von SARS-CoV-2-Proteinen mit MagPlex-Beads unter Verwendung eines Bio-Plex-Amin-Kopplungskits (Bio-Rad) gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt. Jedes der mit unterschiedlichen Mutationen exprimierten SARS-CoV-2-Spike-Proteine ​​wurde mit verschiedenfarbigen MagPlex-Kügelchen gekoppelt, sodass Tests mit einem einzelnen Proteinkügelchen pro Vertiefung oder in einem Multiplex-Luminex-Bindungsassay durchgeführt werden konnten. Bindungskurven für Antikörperaffinitätsmessungen und der Spike-ACE2-Wechselwirkungstest wurden wie zuvor beschrieben16,35 unter Verwendung eines Anti-Human-IgG-PE-Sekundärantikörpers (OneLambda ThermoFisher; H10104; 1:100-Verdünnung) für den Antikörpernachweis im Spike-Luminex-Bindungstest und Anti-Antikörper durchgeführt -Maus-IgG-PE-Sekundärantikörper (OneLambda ThermoFisher; P-21129; 1:100-Verdünnung) im Spike-ACE2-Ersatzneutralisationstest. Kompetitive Bindungsstudien wurden durchgeführt, indem 25 µg ml−1 des angegebenen Konkurrenzantikörpers mit den ursprünglichen 2019-nCoV-RBD-Protein-gekoppelten Luminex-Perlen 30 Minuten lang vorinkubiert wurden. Biotinylierte P5C3-, P2G3-, REGN10933-, REGN10987-, AZD8895-, AZD1061-, ADG-2- oder S309-Antikörper (hergestellt wie oben beschrieben) wurden zu jeder Vertiefung in einer Menge von 1 µg ml–1 hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren 20-minütigen Inkubation. Biotinylierter Antikörper, der in Gegenwart eines Konkurrenten an RBD gebunden war, wurde mit Streptavidin-PE in einer Verdünnung von 1:1.000 (BD Biosciences) angefärbt und auf einem 200 Bioplex-Gerät analysiert. COVID-19-Serumproben von mehr als 100 Spendern wurden im Luminex-Bead-basierten Assay auf die Bindung von IgG-Antikörpern an die SARS-CoV-2-Spike-Trimer-Proteine ​​der Varianten 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta und Gamma überwacht.

Blut von Spendern der ImmunoVax-Studie wurde in EDTA-Röhrchen gesammelt und die Isolierung mononukleärer Blutzellen erfolgte unter Verwendung von Leucosep-Zentrifugenröhrchen (Greiner Bio-one), die gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Dichtegradientenmedium (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare) vorgefüllt waren. Frisch isolierte Zellen wurden mit dem Cocktail aus fluoreszierenden konjugierten Antikörpern gefärbt, die Maus-Anti-Human-CD19 APC-Cy7 (BD Biosciences; 557791; Klon SJ25C1; 5-µl-Titration), Maus-Anti-Human-CD3-BV510 (BD Biosciences; 563109; cKlon UCHT1) enthielten ; 1 µl Titration), Maus-Anti-Human-IgM-FITC (Biolegend; 314506; Klon MHM-88; 2 µl-Titration), Maus-Anti-Human-IgD PECF594 (BD Biosciences; 562540; Klon IA6-2; 3 µl Titration), Maus-Anti-Human-CD27-APC (BD Biosciences; 558664; Klon M-T271; 5 µl-Titration) und Maus-Anti-Human-CD38-V450 (BD Biosciences; 646851; Klon HB7; 5 µl-Titration) mAbs wurden für antigenspezifische B -Zellsortierung, zusammen mit dem vorkomplexierten Spike-Tetramer der Beta-Variante (2 µg in 100 µl), gekoppelt an PE-Streptavidin (BD Biosciences; SA10044; Molverhältnis 4:1). Alle anderen Aspekte der Zellsortierung, des Immortalisierungsprotokolls unter Verwendung von Epstein-Barr-Virus-positiven (EBV)-Überständen von B95-8-Zellen und des Klonens entsprachen den Angaben von Fenwick et al.21. Sequenzen für die mAbs P2G3 und P5C3 werden in den PDB-Einreichungen 7QTI, 7QTK und 7QTJ bereitgestellt.

Alle Verfahren der Biosicherheitsstufe 3 wurden vom Schweizer Bundesamt für Gesundheit genehmigt. Das SARS-Cov-2 D614G-Isolat und der B.1.1.7-Klon wurden bereits beschrieben21. Die frühen Isolate Beta (EPI_ISL_981782), Gamma (EPI_ISL_981707), Delta B1.617.2 (EPI_ISL_1811202) und Omicron B.1.1.529.1 (EPI_ISL_7605546) waren ein freundliches Geschenk von I. Eckerle, Universitätskliniken Genf. Virusbestände wurden in EPISERF-Medium auf Vero E6- oder Calu-3-Zellen (für Omicron) hergestellt, aliquotiert, eingefroren und auf Vero E6-Zellen titriert.

Der Neutralisationstest wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Delta- und Omicron-Isolate, bei denen EPISERF-Medium anstelle von DMEM mit 2 % FCS zur Herstellung serieller Antikörperverdünnungen verwendet wurde. In allen Experimenten wurden gleiche Mengen verschiedener Viren verwendet (1.200 Plaque-bildende Einheiten pro Vertiefung), mit Ausnahme des weniger zytopathischen Omicron-Stamms, bei dem 2,5-mal mehr Viren mit jedem parallel getesteten Antikörper inkubiert wurden.

Am Tag vor der Infektion wurden 293T + ACE2 (± TMPRSS2)-Zellen in mit Polylysin beschichteten Platten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Um eine Viruspopulation unter mAb-Druck zu erzeugen, wurde das Early-Passage-Virus in 1 ml EPISERF mit 2 % FCS verdünnt und mit 0,25 ng ml−1 mAb 1 Stunde lang bei 37 °C in Duplikaten inkubiert. Jede Mischung wurde zu den Zellen gegeben und die Überstände von P1 (Passage 1) wurden 3 Tage später gesammelt und auf 0,45 um SpinX-Filtern geklärt, die 4 Minuten lang bei 4.000 × g zentrifugiert wurden. Aliquote der geklärten P1-Überstände wurden 1:40 in 2 % DMEM verdünnt, mit mAbs wie oben beschrieben inkubiert und 4 Tage lang zur Infektion frischer Zellen verwendet. P2-Überstände wurden wie P1 behandelt und P3-Überstände wurden für die RNA-Extraktion und den anschließenden Selektionsschritt gesammelt. Um auf mAb-resistente Viren zu selektieren, wurden 100 µl der gereinigten, unverdünnten heterogenen P3-Viruspopulation mit 100 µl mAbs bei einer Endkonzentration von 2,5 µg ml−1, 0,625 µg ml−1 oder 0,155 µg ml−1 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert C. Die Mischung wurde dann 3–4 Tage lang in 400 µl 2 % DMEM (1:2 Volumen) auf die Zellen aufgetragen. Die Viren wurden für einige weitere Passagen vermehrt und Aliquote jeder Passage wurden für die RNA-Extraktion und -Sequenzierung verwendet. In Abwesenheit von mAb produzierte Viren wurden gesammelt und parallel zur Kontrolle des Auftretens von Mutationen aufgrund der Zellkulturbedingungen auf die gleiche Weise behandelt.

Das HDM-IDTSpike-fixK-Plasmid (BEI, NR-52514; erhalten von JD Bloom, Fred Hutchinson Cancer Research Center) wurde als Rückgrat für alle Klonierungen verwendet. Für Alpha- und Beta-Klone wurden die HDM-IDTSpike-fixK-NotI/SmaI-Fragmente mit den jeweiligen Alpha- und Beta-Fragmenten der zuvor beschriebenen pTwist-Plasmide21 ausgetauscht. Alpha P681H, T716I, S982A, D1118H und Beta A701V wurden außerdem in den jeweiligen ORFs sowie R346K im D614G-Plasmid durch infusionsvermittelte ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 3 beschriebenen Primer hinzugefügt. Der Delta B1.617.2-Klon wurde erzeugt durch Gensynthese mit einem Codon-optimierten Spike-ORF (GenScript). Der Omicron-ORF wurde aus einer RNA amplifiziert, wie für die Proteinproduktion beschrieben, mit den in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführten Primern. Pseudoviren wurden alternativ mit dem ursprünglichen 2019-nCoV (100976), Alpha/B.1.1.7 (101023) und Beta/B produziert .1.351 (101024) pCAGGS-SARS2-Spike-Vektoren, erhalten von NIBSC. Diese Vektoren wurden mit den Vektoren pMDL p.RRE, pRSV.Rev und pUltra-Chili-Luc (Addgene) in HEK 293T-Zellen in DMEM-Medium + 10 % FCS unter Verwendung von Fugene 6 (Promega) zur Pseudovirenproduktion co-transfiziert. Neutralisationstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt21.

In dieser Studie wurden Cynomolgus-Makaken (Macaca fascicularis) verwendet, die aus mauritischen AAALAC-zertifizierten Zuchtzentren stammen. Alle Tiere wurden in IDMIT-Tieranlagen am CEA, Fontenay-aux-Roses, bei Bedarf unter BSL-2- und BSL3-Eindämmung (Genehmigungsnummer für Tieranlagen Nr. D92-032-02, Préfecture des Hauts de Seine, Frankreich) und in Übereinstimmung mit den europäischen Vorschriften gehalten Richtlinie 2010/63/EU, französische Vorschriften und die Standards for Human Care and Use of Laboratory Animals des Office for Laboratory Animal Welfare (OLAW, Assurance-Nr. A5826-01, USA). Die Tiere wurden vor der Verwendung in der Studie negativ auf Campylobacter, Yersinia, Shigella und Salmonella getestet.

Die Protokolle wurden von der institutionellen Ethikkommission „Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives“ (CEtEA Nr. 44) unter der Erklärungsnummer A20-011 genehmigt. Die Studie wurde vom Ministerium für Forschung, Innovation und Bildung unter der Registrierungsnummer APAFIS 24434-2020030216532863 genehmigt.

In der prophylaktischen Schutzstudie wurden vier weibliche Cynomolgus-Makaken im Alter von 3–6 Jahren nach dem Zufallsprinzip der Kontroll- und der behandelten Gruppe zugeteilt, um die Wirksamkeit von P2G3 LS beim Schutz vor einer Infektion mit dem SARS-CoV-2-Omicron-BA.1-Virus zu bewerten. Die behandelte Gruppe (n = 2 (MF1 und MF2)) erhielt eine Dosis von 10 mg kg-1 des monoklonalen menschlichen IgG1-Antikörpers P2G3 LS, verabreicht durch intravenöse langsame Bolusinjektion über 3–8 Minuten 3 Tage vor der Belastung, während Kontrolltiere (n = 2 parallel (MF3 und MF4)) und historische Tiere (n = 2 (MF5 und MF6)) erhielten keine Behandlung. Die begrenzte Anzahl der verwendeten Tiere war eine erste explorative Bewertung der Wirksamkeit von P2G3 LS im NHP-Modell. In der therapeutischen Studie wurden 16 weibliche Cynomolgus-Makaken im Alter von 3–6 Jahren zufällig zwischen der unbehandelten Kontrolle (n = 4), der 2,5 mg kg−1 P2G3 LS + 2,5 mg kg−1 P5C3 LS (n = 6) und der Mit 5 mg kg−1 P2G3 LS + 5 mg kg−1 P5C3 LS (n = 6) behandelte Gruppen zur Bewertung der Wirksamkeit der P2G3 LS/P5C3 LS-Kombination bei der Unterdrückung und Eliminierung des SARS-CoV-2 Omicron BA.1 Virus. Anschließend wurden alle Tiere einer Gesamtdosis von 105 TCID50 des in Calu-3-Zellen produzierten Omicron B.1.1.529 SARS-CoV-2-Virus (NIH/BEI-Referenz: NR-56462) über die Kombination von intranasalem und intratrachealem Weg ausgesetzt ( Tag 0 in der prophylaktischen Studie und 24 Stunden in der therapeutischen Studie), wobei die Probenentnahme und Tests wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden36. Während der gesamten Studie wurden bei allen NHPs Trachealabstriche, Nasopharynxabstriche und bronchoalveoläre Spülungen durchgeführt, um die Konzentrationen sowohl der genomischen als auch der subgenomischen RNA für das SARS-CoV-2-Virus zu überwachen. Es wurde eine Verblindung durchgeführt, wobei der Techniker, der die Proben auf RNA- und Virustitration analysierte, nicht wusste, welche Behandlungsgruppen bewertet wurden, und alle Tiere und Datenpunkte in die Analyse einbezogen wurden. Die NHP-Probengröße wurde auf der Grundlage der erwarteten starken 1- bis 2-log-Reduktion der viralen RNA in den Tracheal-, Nasopharyngeal- und/oder BAL-Proben ausgewählt, wobei eine wirksame Therapie zu statistisch signifikanten Unterschieden zwischen behandelten und unbehandelten NHPs führen kann . Diese Annahmen zur Stichprobengröße wurden durch die statistischen Unterschiede bestätigt, die bei den viralen RNA-Spiegeln beobachtet wurden und mithilfe der zweiseitigen Mann-Whitney-Tests zum Vergleich von Kontroll- und Behandlungsgruppen ausgewertet wurden.

Die Forschungs- und Entwicklungsabteilung der KU LEUVEN hat ein SARS-CoV-2-Infektionsmodell für Syrische Goldhamster entwickelt und validiert, das für die Bewertung der potenziellen antiviralen Aktivität neuartiger Antikörper geeignet ist37,38,39. Der in dieser Studie verwendete SARS-CoV-2-Stamm, BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020 (EPI ISL 109407976|2020-02-03), wurde aus einem Nasopharynxabstrich eines RT-qPCR-bestätigten asymptomatischen Patienten gewonnen Anfang Februar 2020 aus Wuhan, China, zurückgekehrt. Eine enge Verwandtschaft mit dem prototypischen Wuhan-Hu-1 2019-nCoV-Stamm (GenBank-Zugangsnummer 11 Nr. MN908947.3) wurde durch phylogenetische Analyse bestätigt. Das infektiöse Virus wurde durch serielle Passage auf HuH7- und Vero-E6-Zellen isoliert37; Für die hier beschriebene Studie wurde das Passage-6-Virus verwendet. Der Titer des Virusstamms wurde durch Endpunktverdünnung auf Vero E6-Zellen nach der Reed- und Muench-Methode bestimmt. Live-Virus-bezogene Arbeiten wurden in den High-Containment-Einrichtungen A3 und BSL3+ des Rega-Instituts der KU Leuven (3CAPS) unter den Lizenzen AMV 30112018 SBB 219 2018 0892 und AMV 23102017 SBB 219 20170589 gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt.

Das Hamster-Infektionsmodell von SARS-CoV-2 wurde bereits beschrieben37,39. Die Tiere wurden vor Studienbeginn 4 Tage lang akklimatisiert. Die Unterbringungsbedingungen und Versuchsabläufe wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der KU Leuven genehmigt (Lizenz P065-2020). Weiblichen Hamstern (6–8 Wochen alt) wurde IgG1-Isotypkontrolle (5 mg kg−1), P2G3 LS (5 mg kg−1, 1 mg kg−1 oder 0,5 mg kg−1) oder REGN10933 (5 mg kg−1) verabreicht 1) durch intraperitoneale Injektion. Zwei Tage später wurden die Hamster mit Ketamin/Xylazin/Atropin betäubt, Blutproben entnommen und die Tiere intranasal mit 2,4 × 106 mittleren TCID50 von SARS-CoV-2 geimpft (Tag 0). Die Hamster wurden hinsichtlich Aussehen, Verhalten und Gewicht überwacht. Die am Tag 0 der Studie im Hamsterplasma vorhandenen Antikörperkonzentrationen wurden mit dem oben beschriebenen Luminex-Assay mit Spike-Trimer-gekoppelten Perlen und unter Verwendung von gereinigtem P2G3-LS-Antikörper gemessen, um eine Standardkurve zu erstellen. In diesen Studien wurden keine Kontrolltiere ausgeschlossen. In den behandelten Gruppen wurden Tiere mit nicht nachweisbaren Serumantikörperspiegeln (2 Hamster in der Gruppe mit 5 mg kg-1 P2G3 LS, 1 Hamster in der Gruppe mit 1 mg kg-1 P2G3 LS und 1 Hamster in der Gruppe mit 5 mg kg-1 REGN10933) ausgeschlossen Die Analyse ergab, dass dies auf einen technischen Fehler bei der Arzneimittelverabreichung hindeutete. Am Tag 4 nach der Infektion wurden Hamster getötet und Lungengewebe durch Perlenaufschluss (Precellys) in 350 μl TRK-Lysepuffer (EZNA total RNA kit, Omega Bio-tek) homogenisiert und zentrifugiert (10.000 U/min, 5 Min.), um die Zelle zu pelletieren Trümmer. Die RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Von 50 μl Eluat wurden 4 μl als Vorlage in RT-qPCR-Reaktionen verwendet. RT-qPCR wurde auf einer LightCycler96-Plattform (Roche) unter Verwendung des einstufigen RT-qPCR-Kits iTaq Universal Probes (Bio-Rad) mit N2-Primern und Sonden durchgeführt, die auf das Nukleokapsid abzielten37. Standards der SARS-CoV-2-cDNA (IDT) wurden verwendet, um virale Genomkopien pro mg Gewebe zu exprimieren. Für Endpunkt-Virustitrationen wurden Lungengewebe mittels Bead-Aufschluss (Precellys) in 350 μl minimalem essentiellen Medium homogenisiert und zentrifugiert (10.000 U/min, 5 min, 4 °C), um die Zelltrümmer zu pelletieren. Zur Quantifizierung infektiöser SARS-CoV-2-Partikel wurden Endpunkttitrationen an konfluenten Vero E6-Zellen in 96-Well-Platten durchgeführt. Die Virustiter wurden nach der Methode von Reed und Muench unter Verwendung des Lindenbach-Rechners berechnet und als TCID50 pro mg Gewebe ausgedrückt. Die Probengröße für Hamster wurde auf der Grundlage der erwarteten starken Reduktion der viralen RNA und des infektiösen Virus um >1 log im Lungengewebe ausgewählt, wobei eine wirksame Therapie zu statistisch signifikanten Unterschieden zwischen behandelten und unbehandelten Tieren führen kann. Diese Annahmen zur Stichprobengröße wurden in unserer statistischen Analyse bestätigt. Statistische Unterschiede in den viralen RNA-Spiegeln und der Infektiosität wurden mithilfe der zweiseitigen Mann-Whitney-Tests bewertet, um Kontroll- und Behandlungsgruppen zu vergleichen.

ADCC- und ADCP-Assays wurden wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Änderungen durchgeführt40. Kryokonservierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von gesunden Patienten wurden aufgetaut und bei 1 Million ml–1 in RPMI-Medium (Gibco, Life Technologies), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 IE ml–1 Penicillin, resuspendiert und 100 µg ml−1 Streptomycin (BioConcept). Die Zellen wurden mit 25 ng ml−1 IL-15 (Miltenyi Biotec) 6 Stunden lang stimuliert und ADCC-Effektorzellen wurden aus PBMCs durch Abreicherung von T-Zellen unter Verwendung von Anti-CD3-gekoppelten Magnetkügelchen aus dem EasySep-Kit zur Isolierung menschlicher T-Zellen angereichert ( Stammzelle). Bei den für den ADCC-Assay verwendeten Zielzellen handelte es sich um eine CEM-NK-resistente Zelllinie, die stabil transfiziert wurde, um das ursprüngliche 2019-nCoV-Spike-Protein auf der Zelloberfläche und mit konstitutiver Expression des Luciferase-Gens zu exprimieren (CEM-NKR-Spike-Luc-Zellen). . Im ADCC-Assay wurden CEM-NKR-Spike-Luc-Zellen mit 0,3 µg ml-1 Anti-Spike-Antikörper, 0,3 µg ml-1 Isotyp-Kontrollantikörpern oder einem positiven Anti-HLA-Klasse-I-(MHC)-Kontrollantikörper inkubiert ( Invivogen) bei 0,005 µg ml−1. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurden die CEM-NKR-Spike-Luc-Zellen/Antikörper-Gemische dann über Nacht mit einem Verhältnis von 1:10 von CD3-abgereicherten PBMC-Effektorzellen in RPMI-Medium, ergänzt mit 5 % FBS mit niedrigem IgG-Gehalt, co-kultiviert 1 % Penicillin-Streptomycin in 96-Well-Platten mit U-Boden (Sarstedt). Am folgenden Tag wurde die Zelltötung entweder direkt durch Durchflusszytometrie oder indirekt durch Überwachung der mit dem Zelltod verbundenen Abnahme der Luciferase-Aktivität überwacht. Bei der Durchflusszytometrieanalyse wurden Spike-transfizierte CEM-NKR-Luc-Zellen mit dem PKH26-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Sigma; MINI26-1KT) gefärbt, bevor der ADCC-Assay durchgeführt wurde. Um die Zelltötung zu überwachen, wurden kokultivierte Zellen gewaschen und mit fluoreszierenden konjugierten Antikörpern, Maus-Anti-Human-CD56-AF488 (BD Biosciences; 557699; Klon B159; 5-µl-Titration), Maus-Anti-Human-CD16-FITC (BD Biosciences; 555406; Klon 3G8; 2 µl-Titration) und Maus-Anti-Human-CD4-PECF594 (BD Biosciences; 5562316; Klon RPA-T4; 2 µl-Titration). Annexin V-APC (Invitrogen; 88-8102-72; 2 µl Titration) und Aqua Live/Dead Cell Stain (Invitrogen; L34966; 1:400 Verdünnung) wurden für ADCC-Validierungstests verwendet, Anti-HLA-Klasse-I-Antikörper wurden als verwendet Positivkontrolle (Invivogen; MA1-19027; Klon W6/32; 20 ng ml−1) und Zellen wurden dann unter Verwendung eines FACS LSR II-Zytometers mit Diva-Software v6.1.2 analysiert. Spike-CEM-NKR-Luc-Zellen wurden mit dem PKH26-Fluorochrom kontrolliert und dann wurden tote (Aqua-positiv) und apoptotische/sterbende (Annexin-V-positiv) Zellen auf positiv (Anti-HLA-Klasse I), negativ (Isotyp-Kontrolle) und Test untersucht (Anti-Spike-Antikörper)-Antikörperbedingungen zur Feststellung der ADCC-Aktivität. Im Luciferase-Readout-Assay wurden kokultivierte Zellen in White-Elmer-96-Well-Platten übertragen und die Luciferase-Aktivität wurde mit einem einstufigen Luciferase-Assay-Kit (BPS Biosciences) auf einem Synergy-Plattenlesegerät gemessen. Co-kultivierte Spike-CEM-NKR-Luc-Zellen, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern inkubiert wurden, ergaben im Allgemeinen ein um 5–10 % reduziertes Lumineszenzsignal im Vergleich zu CEM-NKR-Luc-Zellen, die ohne Effektorzellen inkubiert wurden. Positive Kontrollantikörper gegen MHC (Anti-HLA-Klasse I) führten zu einer starken antikörperabhängigen Zelltötung von 60–80 % und Anti-Spike-Antikörper führten zu mittleren Reaktionen.

Für den ADCP-Assay wurden Carboxylat-modifizierte Mikrokügelchen von TransFluoSpheres (1,0 µm Durchmesser, 488 nm/560 nm Anregung/Emission; ThermoFisher) direkt mit dem trimeren Spike-Protein 2019-nCoV oder mit Streptavidin gemäß dem Protokoll des Herstellers gekoppelt. Spike-gekoppelte Perlen wurden gewaschen, in Gegenwart oder Abwesenheit der unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-Spike-Antikörpern 30 Minuten lang inkubiert und dann wurde die Mischung direkt zu der U937-Monozytenzelllinie gegeben, die in einer Platte mit 96 Vertiefungen und U-förmigem Boden (Sarstedt) ausplattiert war ). Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit einem FACS LSR II-Zytometer analysiert, um Zellen mit Spike-Bead-Fluoreszenz zu identifizieren. U937-Zellen, die mit Spike-Beads in Abwesenheit von Antikörpern inkubiert wurden, zeigten im Allgemeinen eine phagozytische Aktivität von <5 %, während mit zunehmender Konzentration von Anti-Spike-Antikörpern eine erhöhte ADCP-Aktivität beobachtet wurde, wobei maximal 100 % der Zellen eine mit Spike-Bead-Phagozytose verbundene Fluoreszenz zeigten. Die ADCP-Aktivität von mit Omicron-Spikes beschichteten Perlen wurde durch Vorinkubieren von Streptavidin-gekoppelten TransFluoSpheres-Perlen mit biotinyliertem Omicron-Spike-Protein, hergestellt wie oben beschrieben, gemessen. Die Perlen wurden nach 30 Minuten gewaschen und im ADCP-Assay verwendet, wie für die direkt gekoppelten trimeren 2019-nCoV-Spike-Perlen beschrieben.

Kryo-EM-Gitter wurden mit einem Vitrobot Mark IV (ThermoFisher) hergestellt. Quantifoil R1.2/1.3 Au 400-Lochkohlenstoffgitter wurden 120 s lang bei 15 mA mit einem PELCO easiGlow-Gerät (Ted Pella) glimmentladen. Omicron Spike (3,0 µl, 0,7 mg ml-1), gemischt mit jeweils 0,16 mg ml-1 P5C3- und P2G3-Fab-Fragmenten (endgültiges Verhältnis von 3,2 µM Omicron Spike:1,5 µM P5C3:1,5 µM P2G3), wurde auf die Glimmentladung aufgetragen Gitter, 6 s lang unter Blotkraft 10 bei 100 % Luftfeuchtigkeit und 4 °C in der Probenkammer geblottet, und das geblottete Gitter wurde in mit flüssigem Stickstoff gekühltem flüssigem Ethan tauchgefroren.

Die Gitter wurden auf einem TFS Glacios-Mikroskop (200 kV) auf Partikelpräsenz und Eisqualität überprüft, und die besten Gitter wurden auf ein TFS Titan Krios G4 übertragen. Kryo-EM-Daten wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop TFS Titan Krios G4 gesammelt, das mit einem Cold-FEG auf einem Falcon IV-Detektor im Elektronenzählmodus ausgestattet war. Die Verstärkungsreferenzen für Falcon IV wurden unmittelbar vor der Datenerfassung erfasst. Die Daten wurden mit TFS EPU v2.12.1 unter Verwendung des aberrationsfreien Bildverschiebungsprotokolls gesammelt, wobei 4 Mikroaufnahmen pro Eisloch aufgezeichnet wurden.

Die Filme wurden mit einer 165.000-fachen Vergrößerung aufgenommen, was einer Pixelgröße von 0,83 Å auf Probenebene entspricht, mit Defokussierungswerten im Bereich von –0,8 bis –2,5 µm. Die Belichtungen wurden automatisch auf eine Gesamtdosis von 60 e−Å−2 eingestellt, was zu einer Belichtungszeit von etwa 3 s pro Film führte. Insgesamt wurden 22.758 mikroskopische Aufnahmen im EER-Format gesammelt.

Die On-the-fly-Verarbeitung wurde zunächst während der Datenerfassung durchgeführt, um die Datenqualität während des Screenings mithilfe von cryoSPARC live v3.3.141 zu bewerten. Die erhaltenen Ab-initio-Strukturen wurden zur besseren Partikelauswahl für die Template-Erstellung verwendet. Die Bewegungskorrektur wurde an Rohstapeln ohne Binning durchgeführt, wobei die cryoSPARC-Implementierung der Bewegungskorrektur42 verwendet wurde. Partikel (1.454.045) wurden automatisch als Vorlage ausgewählt. Es wurden drei Runden zweidimensionaler (2D) Klassifizierung durchgeführt, was zu einem Partikelsatz von 383.541 Partikeln führte. Aus der 2D-Klassifizierung ausgewählte Partikel wurden für die Ab-initio-Rekonstruktion und Hetero-Verfeinerung verwendet. Nach der Hetero-Verfeinerung trugen 189.500 Partikel zu einer anfänglichen 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 2,79 Å (Fourier-Schalen-Koeffizient (FSC) 0,143) und C1-Symmetrie bei. Diese Partikel wurden einer 3D-Klassifizierung unterzogen, was zu 10 Klassen führte. Klasse 9 führte zu einer globalen Karte des Omicron-Spikes mit einem RBD-up, das an einen P5C3- und P2G3-Fab gebunden war, mit einer Auflösung von 3,04 Å (FSC 0,143) und C1-Symmetrie. Eine gezielte Verfeinerung der Klasse 4 mit einem weichen Maskenvolumen, das ein RBD-oben und sein gebundenes Fab sowie ein angrenzendes RBD-unten umfasst, führte zu einer Karte bei 4,01 Å (FSC 0,143) mit C1-Symmetrie. Schließlich führte eine gezielte Verfeinerung der Klasse 5 mit einem weichen Maskenvolumen, das einen RBD-Down und sein gebundenes P2G3 sowie eine angrenzende N-terminale Domäne (NTD) umfasste, zu einer Karte bei 3,84 Å (FSC 0,143) mit C1-Symmetrie. Die Weichmaskenvolumina wurden manuell in UCSF Chimera und cryoSPARC43 generiert.

Ein Modell eines Spike-Trimers (PDB-ID 7QO7; https://www.rcsb.org/structure/7QO7) oder AlphaFold2-Modelle (ColabFold-Implementierung) der P5C3- und P2G3-Fabs wurden mit UCSF Chimera in die Kryo-EM-Karten eingepasst. Diese angedockten Modelle wurden mithilfe von Coot und Phenix44,45 manuell erweitert und verfeinert. Die Abbildungen wurden in UCSF Chimera, UCSF ChimeraX und Pymol43 erstellt. Die Nummerierung der Spike-Modelle in voller Länge innerhalb der globalen Karte basiert auf der Omicron-Nummerierung. Die Nummerierung von Modellen, die nur die RBD in den lokalen Karten enthalten, basiert auf der Wildtyp-Nummerierung. Fab-Nummerierung bei eins von den ersten konstanten Domänen für die schwere (CH1) bzw. leichte Kette (CL). Messungen der vergrabenen Oberfläche und Schwerpunktmessungen wurden in ChimeraX berechnet.

Statistische Parameter, einschließlich der genauen Werte von n, der Definition des Zentrums, der Streuung und der Präzisionsmaße (Mittelwert oder Median ± Standardabweichung) und der statistischen Signifikanz, werden in den Abbildungen und Abbildungslegenden angegeben. Die Daten wurden als statistisch signifikant beurteilt, wenn P < 0,05. In den Abbildungen kennzeichnen Sternchen die statistische Signifikanz, die mithilfe des zweiseitigen, nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Tests für Zweigruppenvergleiche oder des Kruskal-Wallis-Tests mit Dunns Mehrfachvergleichskorrektur berechnet wird. Die Analysen wurden in GraphPad Prism und Microsoft Excel durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und in den Quelldaten verfügbar. Die rekonstruierten Karten der globalen Omicron-Spitze mit gebundenen Fabs sind in der EMDB-Datenbank, C1-Symmetrie, EMDB-14141 verfügbar. Das Atommodell für den Omicron-Spike in voller Länge mit gebundenen Fabs ist in der PDB-Datenbank PDB-7QTI verfügbar. Die lokal fokussierte Verfeinerungskarte des RBD-up mit zwei gebundenen Fabs ist in der EMDB-Datenbank EMDB-14142 verfügbar. Das Atommodell für das RBD-Up mit zwei in der lokal verfeinerten Karte gebundenen Fabs ist in der PDB-Datenbank PDB-7QTJ verfügbar. Die lokal fokussierte Verfeinerungskarte des RBD-Downs mit gebundenem P2G3-Fab ist in der EMDB-Datenbank EMDB-14143 verfügbar. Das Atommodell für den RBD-Down mit gebundenem P2G3-Fab in der lokal verfeinerten Karte ist in der PDB-Datenbank PDB-7QTK verfügbar. Alle in dieser Studie hergestellten Plasmide sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken dem Dienst für Immunologie und Allergie des Universitätsspitals Lausanne für die Analyse von Serumproben auf den Gehalt an Anti-Spike-Protein-IgG-Antikörpern; I. Eckerle, M. Bekliz und das Virologielabor des Universitätsspitals Genf für die Sammlung von Omicron-RNA-Proben und Variantenisolaten; das Geneva Genome Center für Sequenzierung und J. Duc für die Entwicklung interner Skripte für Analysen; L. Durrer, R. Schier, M. François und S. Quinche von der EPFL Protein Production and Structure Core Facility für die Produktion von Säugetierzellen und die Reinigung von Proteinen; A. Myasnikov, B. Beckert und S. Nazarov vom Dubochet Center for Imaging (eine Initiative von EPFL, UNIGE, UNIL) für die Vorbereitung und Datenerfassung von Kryo-EM-Gittern, und D. Demurtas für die Einrichtung von Kryo-EM-Bedingungen für automatisierte Systeme Erwerb in verwandten Studien, die nicht in diesem Manuskript enthalten sind; D. Wyatt und Mitgliedern des CARE-IMI-Arbeitspaket-4-Teams für hilfreiche Diskussionen. GP und RL erhielten einen Zuschuss aus dem Corona Accelerated R&D in Europe (CARE)-Projekt, das vom Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) im Rahmen der Zuschussvereinbarung Nr. finanziert wird. 101005077. Das JU erhielt Unterstützung vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union, der European Federation of Pharmaceutical Industries Associations (EFPIA), der Bill & Melinda Gates Foundation, dem Global Health Drug Discovery Institute und der University of Dundee. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt ausschließlich die Meinung der Autoren wider und das JU übernimmt keine Verantwortung für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen. Zusätzliche Mittel wurden vom Universitätsspital Lausanne (an GP), dem Schweizerischen Impfstoffforschungsinstitut (an GP und NCCR TransCure an HS), CARIGEST SA (an DT und GP), Zuschüssen des Schweizerischen Nationalfonds (an GP) und durch bereitgestellt der EPFL-COVID-Fonds (an DT).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Craig Fenwick, Priscilla Turelli, Dongchun Ni, Laurent Perez.

Dienst für Immunologie und Allergie, Medizinische Abteilung, Universitätsklinikum Lausanne und Universität Lausanne, Lausanne, Schweiz

Craig Fenwick, Laurent Perez, Erica Lana, Céline Pellaton, Line Esteves-Leuenberger, Jérémy Campos, Alex Farina, Flurin Fiscalini und Giuseppe Pantaleo

Fakultät für Biowissenschaften, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Schweiz

Priscilla Turelli, Kelvin Lau, Charlène Raclot, Florence Pojer und Didier Trono

School of Basic Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne und Fakultät für Biologie und Medizin, UNIL, Lausanne, Schweiz

Dongchun Ni & Henning Stahlberg

CEA, Universität Paris Sud 11, INSERM U1184, Zentrum für Immunologie viraler Infektionen und Autoimmunerkrankungen, IDMIT-Abteilung, IBFJ, Fontenay-aux-Roses, Frankreich

Cecile Herate, Roman Marlin, Nathalie Dereuddre-Bosquet, Francis Relouzat und Roger LeGrand

KU Leuven, Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Transplantation, Rega-Institut für medizinische Forschung, Labor für Virologie und Chemotherapie, Leuven, Belgien

Rana Abdelnabi, Caroline S. Foo, Johan Neyts und Pieter Leyssen

VRI, Universität Paris-Est Créteil, Medizinische Fakultät, INSERM U955, Créteil, Frankreich

Yves Levy

Inserm U955, Team 16, Créteil, Frankreich

Yves Levy

AP-HP, Henri-Mondor-Albert-Chenevier-Krankenhaus, Abteilung für klinische Immunologie und Infektionskrankheiten, Créteil, Frankreich

Yves Levy

Schweizerisches Impfstoffforschungsinstitut, Universitätsspital Lausanne und Universität Lausanne, Lausanne, Schweiz

Giuseppe Pantaleo

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CF entwarf die Strategie zur Isolierung und Profilierung von Anti-Spike-Antikörpern, entwarf die Funktionstests, koordinierte die Forschungsaktivitäten, analysierte die Daten, verfasste den ersten Entwurf und trug zur Redaktion des Manuskripts bei. PT erstellte und führte die Experimente mit einem Assay zur Neutralisierung des zytopathischen Effekts des lebenden SARS-CoV-2-Virus durch, entwarf und testete die Spike-Protein-Mutationen und das Klonen mit Hilfe von CR, analysierte die Ergebnisse und trug zur Bearbeitung des Manuskripts bei. LP, DN, KL, FP und HS koordinierten die Kryo-EM-Analyse, analysierten die Strukturdaten, verfassten den Strukturteil des Manuskripts und trugen zur Bearbeitung des Manuskripts bei. Andere Autoren haben wie folgt beigetragen: LE-L. führte die B-Zellen-Sortierung, Immortalisierung, Bindungsstudien und mAb-Funktionstests durch; AF und EL führten die Klonierung von mAb VH und HL durch; JC führte Bindungsstudien, die Produktion ausgewählter Lentiviren und pseudovirale Tests durch; CP führte eine In-vitro-Charakterisierung von Serumantikörpern aus Spenderproben durch; FF führte die mAb-Reinigung, die mAb-Charakterisierung und die Molekularbiologie durch.; CR führte eine ortsgerichtete Mutagenese der Spike-Konstrukte durch; FP koordinierte die Produktion von rekombinantem Spike-Protein und mAb. PL, YL und RL entwarfen die In-vivo-Studien, die von CH, RM, ND-B durchgeführt wurden. FR, RA, CSF und JNGP und DT konzipierten das Studiendesign, analysierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Didier Trono oder Giuseppe Pantaleo.

CF, GP, PT und DT sind Miterfinder einer Patentanmeldung, die die in diesem Manuskript beschriebenen Antikörper und Daten umfasst (EP 22153464.7 und PCT/IB2022/050731). DT und GP gehören zu den Gründern und Eigentümern von Aerium Therapeutics, das Rechte an den in der Veröffentlichung beschriebenen Antikörpern besitzt und deren Entwicklung vorantreibt sowie gesponserte Forschungsvereinbarungen mit dem Universitätsklinikum Lausanne (CHUV) und der Ecole Polytechnique Fédérale abgeschlossen hat de Lausanne (EPFL). Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a) Spike-Bindungskurven (n = 2) und b) Studien zur kompetitiven Bindung zwischen Antikörpern, die an das Spike-RBD-Protein von 2019-nCoV binden. Für Bindungsstudien mit mAbs oder ACE2 wurden RBD-gekoppelte Perlen verwendet, die mit sättigenden Konzentrationen an Konkurrenzantikörpern vorinkubiert wurden. Konkurrenten induzierten entweder eine starke blockierende (rote Kästchen), teilweise kompetitive (orangefarbene Kästchen) oder nicht-kompetitive (weiße Kästchen) Bindung mit dem entsprechenden mAb an RBD. Rote und gelb schraffierte Linien zeigen eine unvollständige Blockierung der Spike-ACE2-Interaktion mit Alpha-, Gamma- und Omicron-Spike-Variantenproteinen an (n = 2 für jede mAb-Kurve und jedes Spike-Protein). c) Spike-ACE2-Blockierungsaktivität einer Reihe firmeneigener, autorisierter und klinisch fortschrittlicher Anti-Spike-mAbs und d) Heatmap mit IC50-, IC80- und Imax-Werten für unsere Reihe von mAbs im Spike-ACE2-Assay. Diese Luminex-basierten Tests wurden mit Perlen durchgeführt, die mit Spike-Trimer-Proteinen der ursprünglichen besorgniserregenden Varianten 2019-nCoV, D614G-Mutante, Alpha, Beta, Gamma und Omicron SARS-CoV-2 gekoppelt waren. Sotrovimab wurde als Kontroll-mAb einbezogen, der das RBD bindet, ohne die Spike-ACE2-Interaktion zu blockieren. e) Repräsentative Daten für die Spike-ACE2-Blockierungsaktivität und die Spike-Bindung für P2G3- und P5C3-mAbs unter Verwendung derselben mit Omicron BA.2 Spike-Trimer beschichteten Luminex-Perlen. Die für P2G3 und P5C3 gezeigten Replikate sind n = 8 und 7 im Spike-ACE2-Assay und n = 4 und 2 im Spike-Bindungsassay. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

Quelldaten

Neutralisierung lentiviraler Partikel, pseudotypisiert mit: a) SARS-CoV-2 Spike, der die R346K-Mutation und die D614G-Substitution kodiert, die zu Beginn der Pandemie dominant wurde, und b) Omicron BA1.1 mit der R346K-Substitution in einem 293T-ACE2-Infektionstest. Die Felder a und b stellen Dreifachkopien aller getesteten mAbs dar, mit Ausnahme von AZD8895 und AZD1061, die in a als Duplikate getestet wurden. c) P2G3 wurde in Assays zur Neutralisierung der zytopathischen Wirkung von Lebendviren mit den ursprünglichen besorgniserregenden Varianten 2019-nCoV und Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron BA.1 mit n = 6, 4, 4, 4, 6 und 6 Replikaten bewertet. jeweils. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

Quelldaten

a) Antikörperabhängiger zellulärer Zytotoxizitätstest (ADCC), durchgeführt mit CEM NKR-Luciferase-Zellen, die den Zelloberflächen-2019-nCoV-Spike stabil exprimieren. P2G3 weist eine starke ADCC-Aktivität bei der Abtötung von Spike-positiven Zellen auf. ADCC-Experimente wurden mit fünf Wiederholungen pro Bedingung unter Verwendung von Effektorzellen von fünf verschiedenen gesunden Spendern durchgeführt, wobei jeder Spender in einem bis drei verschiedenen Experimenten bewertet wurde (n = 50 Tests pro Bedingung). CEM NKR Spike-Zellen wurden mit 0,30 µg/ml der angegebenen humanen IgG-mAbs inkubiert. Violindiagramme werden mit Medianwerten als dicke Mittellinie und Quarile als obere und untere Linie angezeigt. Statistischer Unterschied, bewertet durch Zwei-Wege-ANOVA mit p-Werten, dargestellt als p = 0,0096 (**), p = 0,0001 und 0,0002 (von links nach rechts ***) und p < 0,0001 (****). b) Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für die Auswahl von U937-Zellen, die Entfernung von Zelldubletts und die Bewertung von Zellen, bei denen Spike-beschichtete fluoreszierende Perlen einer Phagozytose unterzogen wurden. Der Schwellenwert für die Spike-spezifische Phagozytose von Perlen wurde unter Verwendung eines Isotopenkontrollantikörpers festgelegt und repräsentative Punktdiagramme für P2G3-vermitteltes ADCP von 2019-nCoV Spike-beschichteten Perlen von U937 werden mit >4000 analysierten Zellen pro Bedingung gezeigt. c, d) Antikörperabhängiger zellulärer Phagozytose-Assay, durchgeführt mit ancestral 2019-nCoV und mit Omicron BA.1-Variante Spike-Protein, biotinyliert und an mit Streptavidin beschichtete fluoreszierende Perlen gebunden. Mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen gemischte Perlen wurden mit der Monozyteneffektorzelllinie U937 inkubiert und die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose der Spike-beschichteten Perlen wurde durch Durchflusszytometrie bewertet. Gestrichelte Linien entsprechen einzelnen Antikörpern und durchgezogene Linien zeigen Kombinationen von P2G3 und P5C3 an. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentative Daten für drei separate Experimente, wobei jede Konzentrationsreaktion doppelt oder dreifach getestet wurde. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

Quelldaten

a) Überblick über das Studiendesign für das SARS-CoV-2-Hamster-Challenge-Modell. Den Tieren wurden intraperitoneal 5,0, 1,0 oder 0,5 mg/kg P2G3, 5 mg/kg der REGN10933-Positivkontrolle oder 5 mg/kg einer IgG1-Isotyp-Kontrolle verabreicht und zwei Tage später (Tag 0) mit einer intranasalen Impfung des Originals 2019 herausgefordert -nCoV SARS-CoV-2-Virus (2,4 × 106 TCID50). b) Die mittleren Werte an infektiösem Virus und c) virale RNA-Kopien/mg Lungengewebe in jedem der Studienarme werden am Tag 4 nach der Inokulation mit dem SARS-CoV-2-Virus angezeigt. Die Behandlungsarme für die IgG-Kontrolle, REGN10933 5 mg/kg, P2G3 5 mg/kg, P2G3 1,0 mg/kg und P2G3 0,5 mg/kg, bestehen aus n = 6, 5, 4, 5 bzw. 6 Hamstern. Nichtparametrische Mann-Whitney-U-zweiseitige Tests wurden verwendet, um den statistischen Unterschied zwischen den Behandlungsbedingungen mit p = 0,0043, 0,0095, 0,0043 und 0,0022 (von links nach rechts, **) in b und p = 0,0043, 0,0095 zu bewerten , 0,0043 und 0,0022 (von links nach rechts, **) in c.

Quelldaten

Kryo-EM-Verarbeitungsworkflow durchgeführt in CryoSPARC v.3.3.1.

a) Die repräsentative mikroskopische Aufnahme stellt eine von insgesamt 22.758 mikroskopischen Aufnahmen (siehe Tabelle 1) dar, die aus einem Raster entnommen wurden. b) Repräsentative 2D-Klassendurchschnitte. c) Vergrößerte 2D-Klasse, die den Omicron Spike mit gebundenen Fabs zeigt. d) Richtungsverteilungsdiagramm und FSC-Kurven, die eine Auflösung von 3,04 Å (FSC 0,143) der globalen Karte (Klasse 9) des an Fabs gebundenen Omicron Spike in voller Länge anzeigen. e) Richtungsverteilungsdiagramm und FSC-Kurven, die eine Auflösung von 3,84 Å (FSC 0,143) der lokal verfeinerten P2G3-gebundenen RBD-Down-Karte (Klasse 5) anzeigen f) Richtungsverteilungsdiagramm und FSC-Kurven, die eine Auflösung von 4,01 Å anzeigen (FSC). 0,143) der lokal verfeinerten Karte P5C3-P2G3-bound-RBD-up (Klasse 4). Globale und fokussierte, verfeinerte Karten, eingefärbt nach lokaler Auflösung.

a) Der vergrabene Oberflächenbereich von P5C3 (rosa), überlagert mit der RBD-Oberfläche (grün). P5C3 vergräbt etwa 500 Å der Oberfläche des Omicron RBD. Spezifische CDR-Schleifen der schweren und leichten Ketten sind angegeben. Omicron-Mutationen werden als Kugeln und Stäbchen und transparente Oberflächen in Gelb dargestellt. b) Vergrößerte Ansicht der interagierenden Region von P2G3. Spezifische CDR-Schleifen der schweren und leichten Ketten sind angegeben. Omicron-Mutationen in der Region des Fab sind gelb hervorgehoben. Interagierende Reste des Fab werden als Stäbchen dargestellt. c) Detaillierte Analyse der Wechselwirkungen auf Atomebene zwischen der Omicron-RBD, dargestellt als Bänder (grün), und den schweren und leichten P5C3-Fab-Ketten, dargestellt als Lakritze (dunkelrot und rosa). Rückstände an der Grenzfläche werden als Stäbchen dargestellt, mögliche Wechselwirkungen sind als gestrichelte Linien dargestellt. Omicron-Mutationen werden gelb dargestellt. d) Überlagerung der P5C3-Omicron-RBD-Schnittstelle mit der P5C3-Wildtyp-RBD-Schnittstelle (PDB; 7PHG).

a) Der vergrabene Oberflächenbereich von P2G3 (grau), überlagert mit der RBD-Oberfläche (grün). P2G3 vergräbt 705 Å der Oberfläche des Omicron RBD. Spezifische CDR-Schleifen der schweren und leichten Ketten sind angegeben. Omicron-Mutationen werden als Kugeln und Stäbchen und transparente Oberflächen in Gelb dargestellt. b) Stick-Darstellung der P2G3-Schnittstelle von CDRH3 und der RBD-Region mit den Resten 440–451. Das Netz stellt die Kryo-EM-Dichte dar. c) Die Überlagerung der P2G3-RBD-Up-Schnittstelle mit der P2G3-RBD-Down-Schnittstelle zeigt keine signifikanten Unterschiede bei erhaltenen Wechselwirkungen. d) Bindung von P2G3-Fabs an die RBD-up-Domäne in Grün und die RBD-down-Domäne in Orange innerhalb des trimeren Spike. e) Stick-Darstellung der P2G3-Schnittstelle des CDRH2-Rests W53, die eine potenzielle Kation-Pi-Wechselwirkung mit dem RBD-Rest R346 bildet. Das Netz stellt die Kryo-EM-Dichte dar.

Modell von Fabs für Antikörper der Klasse 3, REGN10987, AZD1061 und S309/Sotrovimab, die jedes der RBD-Protomer für das vollständige Omicron-Trimer binden. Trimer werden aus mehreren Perspektiven gezeigt, um die unterschiedlichen Angriffswinkel der Fabs je nach Spike-Protomer zu veranschaulichen. a) REGN10987-Fab bindet an die grüne RBD-oben-Konformation, aber modelliertes REGN10987-Fab, das entweder an die RBD-unten-Konformation des orangefarbenen oder blauen Protomers gebunden ist, würde sterisch mit den angrenzenden blauen RBD-unten- bzw. grünen RBD-oben-Protomeren kollidieren. Insgesamt wird vorausgesagt, dass REGN10987 nur RBD-up binden kann. b) Es wird vorausgesagt, dass AZD1061 die RBD-oben-Form und die RBD-unten-Form des blauen Protomers bindet, die modellierte Bindung von AZD1061 Fab an die RBD-unten-Form des orangefarbenen Protomers würde jedoch möglicherweise mit der angrenzenden grünen RBD-oben-Form kollidieren. c) S309/Sotrovimab ist in der Lage, alle RBDs gleichzeitig zu binden, wie für P2G3 gezeigt. d) Der Anstellwinkel der Fabs zum RBD ist definiert als die Linie, die den Schwerpunkt des Fab mit dem Schwerpunkt der Oberfläche des RBD verbindet, die die Fabs begraben.

Neutralisierung lentiviraler Partikel, die mit der Spike-Kodierung der Delta-Variante SARS-CoV-2 pseudotypisiert wurden: a) die P2G3-entkommende K444T-Spike-Substitution und die P5C3-entkommende b) G476D c) F486S-, d) N487K- und e) N487D-Spike-Substitution. Die gezeigten Ergebnisse bestehen aus n = 6 Replikaten für P2G3 und P2G3 + P5C3, n = 5 oder 6 Replikaten für P5C3 und den AZD-Mix und n = 3–5 Replikaten für Sotrovimab. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1 und 2 sowie Tabellen 1–3.

Quelldaten für den Nachweis subgenomischer RNA in der NHP-Studie zur therapeutischen Wirksamkeit.

Quelldaten zur Erstellung von Hemmkurven zur Blockierung der Spike-ACE2-Interaktion.

Quelldaten für Tests zur Neutralisierung der zytopathischen Wirkung pseudoviraler und lebender Viren.

Quelldaten für virale genomische und subgenomische RNA in der NHP-Challenge-Studie.

Quelldaten für virale genomische und subgenomische RNA in der NHP-Studie zur therapeutischen Wirksamkeit.

Quelldaten zur Charakterisierung viraler Escape-Mutationen.

Quelldaten für Spike-Bindungs- und Spike-ACE2-Blockierungsaktivitätstests.

Quelldaten für Pseudoviren- und Lebendvirus-Neutralisationstests.

Quelldaten für ADCC- und ADCP Fc-vermittelte Funktionstests.

Quelldaten für den Nachweis infektiöser Viren und viraler RNA im Hamster-Challenge-Modell.

Quelldaten für pseudovirale Neutralisationstests, die mit Spike-kodierenden P2G3- und P5C3-Escape-Mutationen durchgeführt wurden.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fenwick, C., Turelli, P., Ni, D. et al. Vom Patienten stammender monoklonaler Antikörper neutralisiert SARS-CoV-2-Omicron-Varianten und verleiht Affen vollständigen Schutz. Nat Microbiol 7, 1376–1389 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01198-6

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Eingegangen: 08. Juni 2022

Angenommen: 06. Juli 2022

Veröffentlicht: 25. Juli 2022

Ausgabedatum: September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01198-6

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